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目的：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种高度保守的非典型丝／苏氨酸蛋白激酶,在生物体内可以调控细胞蛋白质的合成、细胞代谢、增殖、生长、自噬以及存活。mTOR作为核心蛋白参与组成mTORC1和mTORC2两种复合体。许多研究表明mTORC1参与了多种肾脏疾病的发生与发展,但是mTORC2信号通路在肾脏疾病中的作用尚不明确。已有研究表明mTORC2在多种细胞中参与了细胞的存活、转分化以及能量代谢,而这些细胞学行为与多种肾脏疾病密切相关。因此,我们想探讨mTORC2信号通路在肾脏疾病包括急性肾损伤与慢性肾脏病中的作用与机制。方法：1.在mTORC2信号通路介导肾小管上皮细胞存活以及急性肾损伤的研究中,我们在大鼠近端小管细胞系NRK-52E细胞中在不同时间点加入顺铂,Western blot检测nTORC2信号通路。利用Rictor siRNA下调Rictor的表达,Western blot检测Cleaved-caspase3,行TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗体免疫荧光染色观察Rictor/mTORC2在体外是否能够影响顺铂诱导的小管细胞凋亡。在NRK-52E细胞中转染GFP-LC3质粒,Scramble siRNA或Rictor siRNA,经顺铂处理后,观察自噬小体的形成；利用Western blot检测LC3活化水平。在NRK-52E细胞中转染GFP-LC3质粒,加入二甲双胍,观察其是否能够诱导自噬。通过Western blot检测Cleaved-caspase3,TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗体免疫荧光染色观察二甲双胍是否能够对抗Rictor下调所导致的细胞损伤。体内实验中,单次腹腔注射顺铂(20mg/kg)诱导小鼠急性肾损伤,1、2、3天后留取肾组织。利用Western blot以及免疫组化染色抗Rictor抗体观察顺铂模型中Rictor在肾脏中的表达与分布。利用Cre-loxp系统构建肾小管上皮细胞Rictor基因特异性敲除小鼠模型(Tubule-Rictor-/-),出生2月后,与对照组小鼠相比较,观察其一般情况是否有明显异常；Western blot以及免疫荧光染色观察Rictor是否被特异性敲除。分别以Tubule-Rictor-/-小鼠和Tubule-Rictor+/+小鼠为研究对象,单次腹腔注射顺铂(20mg/kg)诱导急性肾损伤,于注射后第1、2、3天采集肾组织标本以及血液标本。检测血清尿素氮和肌酐水平观察小鼠急性肾损伤后肾功能变化；利用PAS染色观察肾脏组织学变化并计算肾脏损伤分数。在顺铂处理后第3天的肾脏组织中,利用TUNEL染色以及抗Cleaved-caspase3抗体免疫组化染色观察细胞凋亡；通过抗PCNA抗体以及抗Ki67抗体染色观察两组小鼠小管细胞的增殖；利用抗F4/80抗体以及抗Ly6b抗体免疫荧光染色观察巨噬细胞和中性粒细胞聚集。在顺铂处理第2天的肾组织标本中,利用Western blot以及免疫荧光染色观察p-Akt (Ser473)在两组小鼠肾组织的表达,利用Western blot以及免疫荧光染色检测LC3、电镜检测分析自噬小体,观察小管细胞的自噬水平。2.在mTORC2信号通路调控肾脏成纤维细胞活化以及肾间质纤维化的研究中,我们在大鼠肾脏成纤维细胞系NRK49F细胞中以不同时间点和剂量加入TGFβ1,利用Western blot以及免疫荧光染色检测Rictor/mTORC2信号通路的变化。通过Rictor, Aktl, Akt2siRNA下调相应蛋白,与对照组相比较,观察各蛋白对TGFβ1诱导NRK49F细胞活化的影响。我们在CD1小鼠中,行单侧输尿管结扎(UUO)术作为肾间质纤维化模型,于术后7、14天留取肾脏组织。Western blot以及免疫荧光染色观察肾脏成纤维细胞Rictor/mTORC2信号通路的活化。构建成纤维细胞Rictor基因特异性敲除的小鼠模型(Fibro-Rictor-/-),与对照组小鼠相比较,观察出生2月后肾脏组织学以及一般情况有无明显异常。以Fibro-Rictor-/-小鼠和Fibro-Rictor+/+小鼠为研究对象,行UUO手术,7、14天留取肾脏组织。利用Western blot以及免疫荧光染色观察UUO模型中Akt的磷酸化；在肾组织中行PAS, Masson以及Sirus染色观察肾间质纤维化；利用Western blot以及免疫荧光染色等方法观察Fibronectin, α-SMA, type I collagen的表达；利用TUNEL染色观察细胞凋亡；利用抗F4/80抗体免疫荧光染色观察巨噬细胞在肾间质的聚集。结果：(1)在NRK-52E细胞中,顺铂以时间依赖性的方式激活p-Akt(Ser473)；利用Rictor siRNA转染可以下调Rictor表达,而沉默Rictor可以加剧顺铂诱导的小管细胞凋亡。在NRK-52E细胞中,沉默Rictor可以抑制顺铂诱导的小管细胞自噬,二甲双胍可以诱导细胞NRK-52E发生细胞自噬,并且能够部分对抗Rictor下调所引起的细胞损伤。体内实验部分我们发现腹腔注射顺铂后第2天的肾脏组织,Rictor的蛋白水平略微上升,但是并没有统计学差异；免疫组化的结果显示Rictor主要在肾小管上皮细胞中表达。利用Cre-loxp系统构建肾小管上皮细胞Rictor基因特异性敲除的小鼠模型,在生理状况下,Tubule-Rictor-/-小鼠在出生两个月以后肾功能以及肾脏组织学并没有异常改变。顺铂诱导急性肾损伤,Tubule-Rictor-/-小鼠与对照组相比,表现为更高的血清尿素氮、肌酐水平以及更严重的组织学损伤；Tubule-Rictor-/-小鼠相比于对照组小鼠,无论是近端小管还是远端小管,有更多小管细胞凋亡；两组小鼠在顺铂诱导的急性肾损伤模型中,小管细胞的增殖并没有显著性差异；Tubule-Rictor-/-小鼠在顺铂诱导的急性肾损伤模型中,肾组织有更多中性粒细胞以及巨噬细胞聚集。在顺铂诱导的急性肾损伤模型中,对照组小鼠肾组织Akt(Ser473)的磷酸化水平以及细胞自噬都显著升高；而Tubule-Rictor-/-小鼠的肾组织中,Akt(t(Ser473)的磷酸化以及细胞自噬较对照组明显减少。(2)TGFβ1刺激NRK-49F细胞,能够以时间以及剂量依赖性的方式激活Rictor/mTORC2信号通路。分别利用Rictor.Akt l.Akt2siRNA下调相应蛋白表达,可以抑制TGFβ1诱导的Rictor/mTORC2信号通路激活以及NRK-49F细胞的活化。在体内实验部分,UUO术后7天以及14天的CD1小鼠肾组织中,Rictor/mTORC2信号通路在肾脏成纤维细胞中激活。利用Cre-loxp系统构建成纤维细胞Rictor基因特异性敲除的小鼠模型,在生理状况下,出生2月后,肾功能以及肾脏组织学无明显异常。行UUO手术两周以后,Fibro-Rictor-/-小鼠的肾组织中,Akt的活化较对照组减少；肾间质纤维化以及细胞外基质的堆积较对照组明显减轻。UUO两周的肾组织中,Fibro-Rictor-/-小鼠肾组织中细胞的凋亡以及巨噬细胞的聚集较对照组明显减少。结论：(1) Rictor/mTORC2信号通路在介导肾小管上皮细胞存活以及顺铂诱导的急性肾损伤的过程中发挥重要作用,其可能的机制是通过调控Akt的活化以及诱导小管细胞发生自噬。(2) Rictor/mTORC2信号通路在TGFβ1诱导的成纤维细胞活化与肾间质纤维化的过程中具有重要作用,阻断这条信号通路可以抑制成纤维细胞活化并减轻肾间质纤维化。