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目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是浆细胞异常增生的恶性肿瘤。常规化疗缓解率低,中位生存期短,尽管造血干细胞移植和新的化疗药物如蛋白酶体抑制剂等的应用,明显提高了患者的生存期,但MM仍是一种难以治愈的恶性血液病。去甲斑蝥素(norcantharidine, NCTD)是从斑蝥中提取的抗肿瘤活性成分—斑蝥素的衍生物,现已证实NCTD在体外对于多种肿瘤细胞系具有抑制增殖、诱导凋亡的作用。本实验旨在研究NCTD对人MM细胞株U266的作用并初步探讨可能的作用机制,并研究NCTD联合阿霉素(ADM)抗人MM细胞株U266的作用,为临床应用提供理论依据。方法:1、四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测不同浓度NCTD和ADM对U266细胞的增殖抑制作用(1)NCTD对U266细胞的增值抑制作用:对人MM细胞株U266进行常规培养,应用不同浓度的NCTD(0、2.5、5、10、20、40、80μmol/L)作用于U266细胞48h后,MTT法检测其对U266细胞的生长抑制作用,并计算半数抑制浓度(50% inhibiting concentration, IC50)。(2)NCTD对ADM的化疗增敏作用:将低于IC50浓度的NCTD(0、2.5、5、10μmol/L)分别与ADM(0、0.25、0.5、1、2μmol/L),作用于U266细胞48h后,MTT法检测其对U266细胞的生长抑制作用,并计算IC50。2、倒置相差显微镜下观察不同浓度NCTD和ADM作用于U266细胞后的细胞密度、形态及结构的变化;3、AnnexinⅤ/ propidium iodide (PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡对人MM细胞株U266进行常规培养,设对照组、药物组(NCTD 5μmol/L,ADM 0.25μmol/L)和两药联合诱导组,作用48小时,收集细胞,加入AnnexinⅤ/PI,流式细胞仪检测细胞凋亡。4、分光光度法检测U266细胞caspase-3、caspase-8、caspase -9蛋白的活性变化对U266细胞进行常规培养,设实验组与对照组,用20μmol/L NCTD对人MM细胞株U266进行干预,作用12、24、36和48小时。分光光度法检测U266细胞caspase-3、caspase-8、caspase -9蛋白的活性变化。5、免疫组化检测Survivin蛋白的表达人MM细胞株U266进行常规培养,设NCTD(20μmol/L)组与对照组,作用12、24和48小时。免疫组化检测Survivin蛋白的表达,分析阳性表达率。结果:1、NCTD对U266细胞增殖的影响MTT法检测,NCTD在体外对人MM细胞株U266生长存在抑制作用,并在一定范围内(0~80μmol/L)呈剂量依赖关系,数据分析得出NCTD作用48h对U266细胞生长的半数抑制浓度(IC50)为22.046μmol/L。2、NCTD联合ADM抗人MM细胞株U266的作用(1)各实验组IC50的变化:ADM单用48h,U266细胞的IC50为1.23±0.06μmol/L,与非抑制浓度NCTD(2.5、5、10μmol/L)联用后分别降低为1.02±0.11μmol/L (P<0.05)、0.74±0.07μmol/L (P<0.05)、0.46±0.04μmol/L(p<0.05);(2)各组凋亡率的变化:药物作用48h后,Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,空白对照组2.8±0.43%,两药联合作用后为44.3±2.20% ,高于单用NCTD(5μmol/L)的12±1.21%和单用ADM (0.25μmol/L)的14.2±3.51%,(与各单用组比,p<0.05)。(3)凋亡的形态学变化:NCTD及ADM作用后,U266细胞株呈现出凋亡的形态学改变,NCTD联合ADM组细胞凋亡形态改变较ADM单用组明显,而对照组细胞生长旺盛,未见细胞凋亡形态学变化。3、NCTD对U266细胞凋亡相关蛋白表达的影响随着NCTD作用时间的延长,U266细胞的Caspase-3、-8、-9蛋白活化程度逐渐升高,其活性在一定时间范围内(0~48h)与NCTD的作用时间呈正相关,即NCTD对U266细胞的Caspase-3、-8、-9活性改变呈时间-效应关系。应用NCTD IC50作用U266细胞不同时间(12h、24h、48h)后,Survivin蛋白阳性表达率明显低于对照组,随着药物作用时间的延长,变化越明显。结论:1、NCTD对人骨髓瘤U266细胞具有生长抑制作用,其生长抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡有关。2、NCTD可以增强ADM的抗骨髓瘤效应。3、NCTD通过下调survivin的表达,上调caspase-3、-8、-9的表达,可能是促进U266细胞发生凋亡的原因之一。