【摘 要】
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目的:铝（Aluminum,Al）作为一种对人体有害的神经毒性物质,主要在大脑中蓄积,长时间铝的暴露会引起神经退行性疾病的发生。经研究表明,线粒体自噬功能的障碍会导致多种神经退行性疾病,铝的接触可能触发神经细胞发生线粒体自噬;另有研究表明铝会导致SIRT1表达降低,提示SIRT1可能在铝致神经元线粒体自噬中发挥重要作用。但铝是如何通过SIRT1调节线粒体自噬的机制尚不清楚。本研究通过检测铝暴露对S
【基金项目】
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国家自然科学基金:BRCA1调控mtDNA氧化损伤在铝暴露损害认知功能中的作用及机制（No.81673223）； 辽宁省教育厅项目:乳腺癌易感基因1调控Nrf2/ARE通路在铝暴露损害认知功能中的作用及机制（No.LK201615）；
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目的:铝（Aluminum,Al）作为一种对人体有害的神经毒性物质,主要在大脑中蓄积,长时间铝的暴露会引起神经退行性疾病的发生。经研究表明,线粒体自噬功能的障碍会导致多种神经退行性疾病,铝的接触可能触发神经细胞发生线粒体自噬;另有研究表明铝会导致SIRT1表达降低,提示SIRT1可能在铝致神经元线粒体自噬中发挥重要作用。但铝是如何通过SIRT1调节线粒体自噬的机制尚不清楚。本研究通过检测铝暴露对SIRT1/SIRT3-FOXO3A-PINK1/PARKIN通路调控线粒体自噬的影响及可能机制,为阐明铝致神经退行性疾病的具体机制提供实验依据和线索。研究方法:本研究采用的是体内外相结合方法。首先通过饮水染铝的方法建立3个月大鼠模型。再通过避暗试验检测大鼠学习和记忆能力。然后建立体外细胞铝暴露模型,选用SH-SH5Y细胞进行试验,NSE免疫荧光法对其进行神经元特性鉴定。采用MTS法测定细胞活力,确定铝和干预剂白藜芦醇、EX-527的染毒剂量。显微镜下观察细胞的形态变化;试剂盒检测其GSH水平;ELISA法检测ATP水平;用Mito SOX?Red法测量线粒体ROS水平;RT-PCR检测Sirt1及其下游Foxo3a、Pink1、Lc3 m RNA水平;Western blot印迹分析检测SIRT1、SIRT3及其下游FOXO3A、PINK1、PARKIN及LC3、P62的表达水平;免疫荧光法测定Ace-FOXO3A蛋白表达水平;激光共聚焦法测定线粒体溶酶体的共定位情况。使用SPSS 18.0软件对上述结果进行统计分析。结果:1.体内实验表明:学习记忆能力。亚慢性铝暴露大鼠在穿梭箱试验中,6 h、24 h错误次数明显增加,被动逃避潜伏期明显缩短。2.铝暴露对大鼠皮质SIRT1、SIRT3及其下游FOXO3A、PINK1、PARKIN及LC3、P62 m RNA和蛋白水平的影响。随着染铝浓度的增加,大鼠皮质Sirt1 m RNA水平降低、Foxo3a、Pink1、Lc3 m RNA水平升高;SIRT1、SIRT3蛋白水平均逐渐降低,下游FOXO3A、PINK1、PARKIN及LC3、P62蛋白水平随着染铝剂量的升高逐渐升高,添加RES后以上结果均相反。3.体外实验表明:随着铝浓度的增加,SH-SY5Y细胞存活率逐渐下降。4.铝会导致SH-SY5Y细胞GSH水平显著降低,白藜芦醇RES干预后,可以逆转上述结果,EX-527干预后,GSH水平进一步下降。5.氯化铝染毒浓度的增加会引起细胞线粒体ROS上升,ATP水平下降,RES处理后线粒体损伤有所恢复,EX-527处理后更加严重。6.随着氯化铝染毒浓度的增加,细胞SIRT1、SIRT3蛋白含量显著下降,加入RES后有所增加,EX-527干预后有所下降;下游FOXO3A、PINK1、PARKIN及LC3、P62 m RNA及蛋白水平均随着染铝剂量的升高逐渐升高,添加RES后有所下降,EX-527干预后有所上升。7.免疫荧光结果提示4 m M Al Cl3组FOXO3A乙酰化水平明显增加,白藜芦醇干预后其乙酰化水平有所下降,EX-527处理后显著升高。8.激光共聚焦结果显示铝会引起线粒体溶酶体共定位增加,添加RES后共定位有所下降,EX-527干预后有所上升。结论:1.铝暴露使大鼠学习记忆能力下降。2.铝暴露使神经细胞形态发生损伤,细胞存活数量降低。3.铝暴露可引起神经细胞线粒体功能损伤。4.铝暴露可下调SIRT1、SIRT3水平,进而引起FOXO3A、PINK1、PARKIN及LC3、P62水平的上调,自噬溶酶体共定位上升,导致线粒体自噬被异常激活。5.铝暴露可加重FOXO3A乙酰化水平。6.SIRT1激动剂RES干预后对上述过程有保护作用,SIRT1抑制剂EX-527干预后对上述损伤有加重作用。提示SIRT1/SIRT3-FOXO3A-PINK1/PARKIN通路在铝暴露导致的线粒体自噬中发挥重要的调节作用。
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