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一、目的和意义： 血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖及表型转化在肺动脉高压、高血压、动脉粥样硬化及冠状动脉成形术后再狭窄等的形成过程中具有重要作用，而衰老、缺氧及内毒素分别是疾病发生的独立危险因素。本实验探讨衰老、缺氧及内毒素对体外培养的肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC)的影响，特别是对PASMC的增殖、转化、c-fos和c-jun原癌基因的影响，并尝试用D—半乳糖刺激青年PASMC建立衰老PASMC模型，为进一步在细胞水平研究人类衰老自然过程及病理过程的机理提供理论和实验依据。 二、材料与方法： 将分离培养的斯普拉格 道利鼠(Sprague-Dawley rat，SD 大鼠)PASMC分为青年常氧组(A组)、老年常氧组(B组)、青年缺氧组(C组)、老年缺氧组(D组)、青年内毒素组(E组)、老年内毒素组(F组)、半乳糖刺激组(G组)、葡萄糖刺激组(H组)，A、B两组用来观察正常培养条件下衰老对PASMC的影响，C、D两组用于观察缺氧对PASMC的影响，E、F两组则用来研究内毒素刺激的作用，G组用来建立PASMC衰老模型，H组是G组的对照组。 本实验用光镜、纤维状肌动蛋白(Filamentous actin，F—actin)的荧光染色观察PASMC的形态和细胞骨架；应用~3H-TdR掺入法观测PASMC短时间内的增殖情况；应用MTT比色法描绘PASMC的生长曲线；用流式细胞术、增殖细胞核抗原(Proliferation cell nuclear antigen，PCNA)的免疫组化染色定量特异地对细胞增殖进行鉴定；用a—平滑肌肌动蛋白(a—Smooth Muscle actin，SM—α—actin)免疫组化测定用来鉴别第一军医人学硕卜学位论文细胞的表型转化;采用RT一PCR检测原癌基因C一fos和c一jun mRN八水平，用免疫组化方法进行C一fos和C一jun蛋白测定，观测C一fos和C一j。。在不同培养条件下的表达水平。 妞、结果分析: 同青年组比较，老年组PASMC形态与细胞骨架无明显差异，:，H一TdR掺入明显增加，生长曲线明显抬高，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋白量减少，pCNA增加;细胞内SM一a一actin水平明显下降;C一fos mRNA水平和C一fos蛋自表达也相应增加;c一jun mRNA水平和c一jun蛋白两者相比并无统计学意义。在缺氧、内毒素刺激条件下，老年组和青年组PASMC比较，也有类似的结果。 同常氧组比较，缺氧组队SMC细胞体积肥大，“峰一谷”现象不明显，细胞呈增殖表型;胞浆中的F一。Ctin部分区域较密集，排列稍紊乱;叭一rrdR掺入明显增加，生长曲线明显抬高，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋自量减少，尸CNA增加;细胞内SM一a一actin水平明显卜降;C一jun和C一f0Sm尺NA水平、蛋白表达也相应增加。 同正常培养墓组比较，内毒素刺激组pASMC比较致密，细胞体积大小不一致，分布稍杂乱，收缩型和增殖型细胞均存在;F一act in在胞浆的分别较不均匀，部分融合和吸补，排列较为紊乱;:‘日一TdR掺入明显增加，生长曲线明显抬高，进入有丝分裂期的细胞比例明显增加，总蛋自嗽减少，I，CNA增力11:细胞内S劝一a一、，C t in水平明显下降;c一jun不Ile一f、()5 ml之NA水‘F、蛋自表达也明显增加。 同占年组比较，D一半乳糖刺激的l)ASMC形态与细胞骨架无明显差异，:叭一Td尺掺入明显增加，‘!毛长曲线明显抬高，进入有丝分裂期的细胞比佰一Jlj)l显增加，总蛋自量减少，r〕eNA增力日;细胞内SM一a一:letin水‘}元明扯l‘降;c一f’()、ml丈NA水平和C一r()、蛋广!表达也相应增加;c一、jonm尺NA水平和C一‘j。。蛋自两者相比并无统计学怠义。华本】，d老年组l叭SMC变化 致。[)一ffi]-萄糖刺激的}，八SMC各个指标的变化则类似常氧占年组。 四、结沦: l、1司;，了年大鼠的!，ASMC丰目比，老年人鼠分离培养的I，ASMC在体外有更高的增殖水平，更多的细胞山收缩型转化为增殖型，细胞大体形态和细胞骨架无明显差异;C一比5 mRNA水平和C一比S蛋白表达也相应增 一4-缺认、衰老和内毒索对大鼠肺动脉‘!元滑)讥细胞培养的影响加，说明c一fos同平滑肌细胞的衰老有密切关系;c一jun tnRNA水平和c一jun蛋白两者相比并无统计学意义，说明C一jun在平滑肌细胞衰老的进程中的作用还值得进一步商讨。说明老年PASMC本身就具有较高的增殖水平，月_比较容易由收缩型向增殖型转化。 2、短时间的缺氧刺激(6小时内)对细胞生长有抑制作用，6小时后能直接刺激PASMC增殖加速，并使细胞的SM一a一actin减少，细胞山收缩型向增殖型转化增加;C一fos和c一j un mRNA水平和c一tj)、和c一jon蛋白表达也相应增加，从分子水平说明了缺氧引起细胞增殖水平增加;老年细胞受缺氧刺激敏感，增殖最快，细胞表型转化比例也最大。提小在慢性阻塞性肺疾病中，缺氧木身就是个刺激l叭SMC增‘}二和转化的一币要因素。 3、短时问的内毒素刺激(12小时内)对细胞生长有抑制作川，然而在适当浓度内毒素刺激下，PASMC 12小时后增殖速度加快，转化为增?