帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又名震颤麻痹,是以选择性中脑黑质致密部(substantia nigra compacta,SNpc)多巴胺能(dopaminergic,DA)神经元进行性丢失而导致运动功能紊乱的与年龄密切相关的神经退行性疾病。90%以上的患者超过了50岁。PD的发病率逐年上升,这与平均寿命的增加有关。在众多影响因素中,衰老是PD的首要风险因素,而细胞老化是驱动衰老的关键环节。细胞老化(cellular senescence)是指细胞因发生不可逆的细胞周期阻滞而停止分裂的现象。引起细胞老化的原因有很多,包括氧化应激、DNA损伤、原癌基因激活、染色质端粒长度过短等。现已阐明细胞老化是动脉粥样硬化、创伤性骨关节炎及自然衰老的重要风险因素。最新研究表明,细胞老化尤其是星形胶质细胞老化在PD中发挥了重要作用。在PD的病理进程中,研究证实发生老化的神经细胞主要是星形胶质细胞,选择性清除这些老化的星形胶质细胞能显著减轻DA神经元的损伤,缓解PD样症状并延缓PD的进程。这些研究表明:星形胶质细胞老化在PD的发展进程中发挥了非常关键的作用。因此,加强对PD中星形胶质细胞老化发生机理的研究,发现能够调节星形胶质细胞老化的关键靶标,靶向调节星形胶质细胞老化,有望成为PD治疗的新途径。我国对于天然药物抗衰老的研究有着非常悠久的历史。其中,豆科植物黄芪(Astragalus)的药用早在汉代《神农本草经》中就有记载,作为“补气固表之圣药”,在抗衰老方面也有非常多的研究。黄芪的重要成分之一黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)为黄芪药理活性成分中生物活性最强的三萜皂苷类化合物。目前,黄芪甲苷被报道对局灶性脑缺血/再灌注、心血管疾病、肺病、肝纤维化和糖尿病肾病具有有效的保护作用。实验室前期工作也证实了黄芪甲苷对PD模型小鼠的神经保护作用,但联系到衰老的确切机制目前尚不清楚。本文通过在体制备MPTP亚急性PD模型小鼠研究黄芪甲苷对抗PD模型小鼠星形胶质细胞老化的效应;离体培养自然老化的原代星形胶质细胞,同时应用了PD相关的细胞刺激模型(脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)模型、1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)模型)研究黄芪甲苷对原代星形胶质细胞老化损伤的保护效应及其机制。目的:研究黄芪甲苷对星形胶质细胞老化损伤的保护效应及其机制。方法:在体研究,应用C57BL/6J遗传背景4月龄小鼠,将其随机分为生理盐水组、黄芪甲苷+生理盐水组,MPTP亚急性模型组,黄芪甲苷+MPTP亚急性模型组。1.通过Western Blot检测各组中脑组织酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达情况;通过免疫组化检测各组TH+神经元的数量。2.通过免疫荧光共定位检测各组星形胶质细胞特征性生物标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)与老化相关指标p16Ink4a、Lamin B1的共标情况;通过RT-PCR检测各组中脑组织老化指标的表达水平。离体研究,应用出生1～3天的C57BL/6J新生小鼠提取原代星形胶质细胞。通过体外反复传代的方法获取老化的原代星形胶质细胞。所有细胞经传代2次纯化后,应用星形胶质细胞特征性生物标记物GFAP确认星形胶质细胞阳性率>95%时即可用于实验。对照组为离体培养10天开始给药给至离体培养20天的星形胶质细胞,实验组为离体培养30天开始给药给至离体培养40天的老化星形胶质细胞。将对照组和老化组的星形胶质细胞分别给予0 μM、1 μM、10 μM、50μM、100 μM、200 μM的黄芪甲苷,在给药第4、7天更换含有相应浓度药液的培养基。1.通过CCK-8检测黄芪甲苷对原代星形胶质细胞的安全浓度范围。2.通过衰老相关的 β-半乳糖苷酶(Senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-gal)检测试剂盒对各组星形胶质细胞进行染色,观察各组细胞SA-β-gal的染色情况;通过Western Blot检测各组星形胶质细胞老化指标p16Ink4a蛋白的表达情况;通过免疫荧光共定位检测各组星形胶质细胞核膜核纤层蛋白B1(Lamin B1)的表达情况;通过RT-PCR检测各组衰老相关的分泌表型(Senescence-associated secretory phenotype,S ASP)的表达情况。综合上述检测方法,确定黄芪甲苷对抗星形胶质细胞老化损伤的有效浓度。3.通过给予上述黄芪甲苷有效抗星形胶质细胞老化的浓度进行预保护,再对星形胶质细胞给予LPS、MPP+刺激以模拟老化损伤,观察该浓度黄芪甲苷对两种刺激下的原代星形胶质细胞老化损伤的保护效应。4.通过流式细胞术检测对照组、对照+给药组、老化组、老化+给药组的原代星形胶质细胞线粒体损伤和线粒体活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)的生成情况。5.通过Western Blot检测对照组、对照+给药组、老化组、老化+给药组的原代星形胶质细胞胞浆中自噬相关蛋白p62、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的表达情况,以及线粒体蛋白中自噬相关蛋白Parkin、Pinkl、TOM20的蛋白表达情况。6.将老化组原代星形胶质细胞分为老化组、老化+自噬抑制剂:6-氨基-3-甲基嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)组、老化+给药组、老化+给药+3-MA组,通过Western Blot、SA-β-gal染色、RT-PCR检测各组老化指标的表达情况。结果:1.黄芪甲苷减轻MPTP亚急性PD模型小鼠多巴胺能神经元的丢失 黄芪甲苷预保护的MPTP亚急性PD模型小鼠中脑TH蛋白表达增多并且中脑SNpc区神经元丢失减少。2.黄芪甲苷抑制MPTP亚急性PD模型小鼠星形胶质细胞老化 MPTP处理引起小鼠星形胶质细胞老化,黄芪甲苷预保护的MPTP亚急性PD模型小鼠黑质致密部(SNpc)星形胶质细胞p16Ink4a表达下降,星形胶质细胞核膜Lamin B1表达上升,并且中脑组织老化指标p16Ink4a、p21等的表达水平下降。3.黄芪甲苷在0～200 μM浓度范围内对原代星形胶质细胞增殖活性没有影响 对于体外培养20天的原代星形胶质细胞分别给予0μM、1μM、10 μM、50μM、100 μM、200 μM的黄芪甲苷,在给药第4、7天更换含有相应浓度药液的培养基。给药第10天通过CCK-8检测各组原代星形胶质细胞生存率。结果表明黄芪甲苷在0～200 μM浓度范围内对原代星形胶质细胞增殖活性没有影响。4.黄芪甲苷可抑制星形胶质细胞的老化 黄芪甲苷在0～200 μM浓度范围内对年轻对照组原代星形胶质细胞SA-β-gal阳性率无影响,50 μM时可降低老化组原代星形胶质细胞SA-β-gal阳性率;黄芪甲苷在0～200 μM浓度范围内对年轻组原代星形胶质细胞老化指标p16Ink4a的表达无影响,在50 μM时可降低老化组原代星形胶质细胞老化指标p16Ink4a的表达;黄芪甲苷对年轻组原代星形胶质细胞SASP分泌无影响,50 μM时可减少老化组原代星形胶质细胞SASP(如IL-6、IL-1β等)的分泌。5.黄芪甲苷可抑制LPS、MPP+刺激引起的星形胶质细胞老化 LPS、MPP+刺激会引起原代星形胶质细胞的老化损伤,而50μM黄芪甲苷预处理可降低LPS、MPP+刺激引起的星形胶质细胞老化指标p16Ink4a的表达以及减少SASP的分泌。6.黄芪甲苷可减轻老化星形胶质细胞的线粒体损伤 MitoSOX和JC-1的流式细胞分析检测结果提示老化组星形胶质细胞线粒体ROS生成增多,线粒体损伤加重,50 μM黄芪甲苷处理的老化组星形胶质细胞线粒体ROS生成减少,线粒体损伤显著下降。7.黄芪甲苷促进老化星形胶质细胞线粒体自噬 相比于年轻组星形胶质细胞,老化组星形胶质细胞胞浆蛋白中自噬相关蛋白p62表达增多,LC3 Ⅱ/Ⅰ比值降低,线粒体蛋白中自噬相关蛋白Parkin、Pink1表达下降,TOM20表达增多,说明老化的星形胶质细胞发生了自噬功能障碍。黄芪甲苷处理的老化组星形胶质细胞胞浆蛋白中自噬相关蛋白p62表达下降,LC3 Ⅱ/Ⅰ比值上升,线粒体蛋白中自噬相关蛋白Parkin、Pink1表达上升,TOM20表达下降,说明黄芪甲苷处理促进了老化星形胶质细胞的线粒体自噬。8.黄芪甲苷通过促进线粒体自噬抑制星形胶质细胞老化 应用自噬抑制剂3-MA预处理老化组细胞抑制自噬后,黄芪甲苷不能下调星形胶质细胞老化指标p16Ink4a的表达、降低表达SA-β-gal细胞的阳性率以及减少老化星形胶质细胞SASP的分泌。结论:1.黄芪甲苷通过抑制星形胶质细胞老化发挥对PD模型小鼠的神经保护作用。2.黄芪甲苷通过促进线粒体自噬抑制星形胶质细胞老化。综上所述,本文的创新之处在于:1.本研究在体外制备了自然老化的星形胶质细胞作为离体研究PD的模型,联系了PD作为年龄相关疾病的现象。2.本研究将星形胶质细胞老化和PD联系起来,探究了天然产物黄芪的药理活性成分——黄芪甲苷对星形胶质细胞老化损伤的保护效应并且阐明了黄芪甲苷对抗星形胶质细胞老化的机制。