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目的：组织工程的发展为骨缺损的修复治疗开辟了一条崭新的道路。然而对于大型哺乳动物大范围或受区血供不佳的骨缺损,由于组织工程骨植入体内后不能及时与机体建立有效血液循环,成骨效果不稳定。组织工程骨的血管化成为目前骨组织工程的研究重点。目前构建血管化组织工程骨的方法主要包括支架设计开发、应用细胞因子、体外联合内皮祖细胞和体内预血管化等。体外联合内皮祖细胞的方法在大动物体内研究较少；体内预血管化的方法探讨较多,但缺乏横向比较。为此,我们采用不同血管化策略在比格犬体内构建组织工程骨,明确体外联合内皮祖细胞的方法对组织工程骨成骨效果的影响,比较两种体内预血管化方法的成血管和促进成骨作用,为临床构建血管化组织工程骨提供参考。研究方法：1.应用密度梯度离心结合贴壁筛选法分离、培养、扩增比格犬BMSCs,并将BMSCs向骨、软骨和脂肪方向诱导分化鉴定；应用密度梯度离心法和差速贴壁法分离比格犬骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs),并进行表面标志和细胞功能鉴定。2.在体外构建EPCs/BMSCs/TCP、EPCs/TCP、BMSCs/TCP细胞支架复合物,植入裸鼠皮下,分别在术后6周和12周取材,Micro-CT和组织学检测各组的成骨能力。3.在体外构建EPCs/BMSCs/TCP和BMSCs/TCP细胞支架复合物,植入比格犬下肢肌肉袋内,术后12周取材,Micro-CT、组织学和免疫组织化学检测各组的成血管及成骨能力。4.通过显微外科的技术,吻合比格犬下肢隐动静脉,形成动静脉环路(AVLoop),构建AV Loop血管化组织工程骨模型；同时采用比格犬隐动静脉远端结扎后置入细胞支架复合物内,构建血管束置入(Vascular bundle,VB)血管化组织工程骨模型；在术后不同时间点通过CTA和B超进行模型验证。5.组织工程骨体内构建6月后取材,采用灌注Microfil观察、Micro-CT扫描并重建分析、以及组织学染色比较VB组和AV Loop组的组织工程骨血管化的差异。6.在不同时间点测量组织工程骨CT值；体内构建6月后取材,采用Micro-CT扫描分析,以及组织学染色比较VB组和AV Loop组的组织工程骨成骨效果的差异。结果：1.种子细胞的分离、培养和鉴定:BMSCs能够向骨、软骨和脂肪方向分化；EPCs能够摄取DiI-ac-LDL和结合FITC-UEA-1,在Matrigel上形成血管腔样结构并且VWF染色呈现阳性。2.联合EPCs裸鼠体内构建组织工程骨：联合EPCs组的骨密度和成骨面积均高于单独BMSCs组(p<0.05)。3.联合EPCs比格犬体内构建组织工程骨：Micro-CT和组织学分析显示,联合EPCs和单独BMSCs的骨密度和成骨面积无统计学差异(p>0.05)；VWF免疫组织化学分析表明,联合EPCs组的血管数量高于单独BMSCs组(p<0.05);CT值分析提示,联合EPCs组相对CT值高于单独BMSCs组(p<0.05)；组织学成骨面积分析提示,联合EPCs成骨面积大于单独BMSCs组(p<0.05)。4.不同体内预血管化方法的模型：CTA检测提示AV Loop组的血管环在第2W、4W、8W通畅,B超证实血管环在6月仍通畅；VB组血管束不显影。5.不同体内预血管化方法构建组织工程骨的成血管比较：灌注Microfil并进行Micro-CT扫描分析,结果表明VB组和AV Loop组生成的血管总体积和表面积无明显差异(p>0.05)；VWF免疫组织化学分析显示VB组和AV Loop组的血管数量无明显差异(p>0.05)。6.不同体内预血管化方法构建组织工程骨的成骨比较：CT、Micro-CT以及组织学分析显示,VB组和AV Loop组的组织工程骨骨密度和成骨面积均无明显差异(p>0.05)。结论1.联合EPCs作为种子细胞在裸鼠体内能够促进BMSCs的成骨；联合EPCs作为种子细胞在比格犬体内能够促进组织工程骨的成骨和血管生成。2.采用比格犬下肢隐动静脉可以成功构建体内AV Loop及VB血管化组织工程骨模型,为构建大体积血管化组织工程骨提供了参考方案。3.采用VB及AV Loop体内血管化均能提高组织工程骨的血管化和成骨效果,并且两种方法促进组织工程骨血管化和成骨的效果无明显差异；而VB组具有手术操作简单和成功率高的优势。