高压氧促进炎性髁突软骨细胞外基质表达作用的研究

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目的:探讨高压氧调节P13K/AKT信号通路促进炎性髁突软骨细胞表达细胞外基质的作用。方法:体外培养3-4周SD大鼠髁突软骨细胞。在无菌环境下,取双侧髁突,以含有双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)冲刷并剥离软骨,反复剪切至1mm3大小,首先在37℃环境下用0.25%浓度的胰蛋白酶消化30分钟,然后37℃振荡加入浓度为0.2%的Ⅱ型胶原酶,1-2小时消化完后、分离原代软骨细胞并培养,通过倒置显微镜每天观测原代软骨细胞生长、形态变化,并用细胞形态学、Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定培养结果。随机将第2代处于对数生长期髁突软骨细胞分为四组,分别用0、0.1、1、10ng/ml IL-1β处理24小时,对各组之间Ⅱ型胶原、AGG蛋白和ⅠnRNA表达量进行检测,并筛选出能造成髁突软骨细胞炎性状态的IL-1β最佳浓度;取第2代处于对数生长期髁突软骨细胞随机分为四组:对照组,细胞不做任何处理;IL-1β组,lOng/ml IL-1β处理24小时;HBO组,lOng/ml IL-1β处理24小时后HBO每天处理90分钟,共四天。Inhibitor+HBO 组:10ng/ml IL-1β处理24小时,提前一小时加入25uMLY294002(PI3K抑制剂)后HBO每天处理90分钟,共四天。分别用CCK-8法检测各组细胞增殖活性;western blotting、免疫组化或者免疫荧光检测各组之间collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT的蛋白表达量;qRT-PCR检测各组collagen Ⅱ、AGG、PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT mRNA表达量。结果:(1)消化髁突,提取软骨细胞接种,观察见细胞呈形态规则、小球形。一天后,多数细胞贴附于培养瓶底,镜下观察可呈多角形;5天后,可观察到“铺路石”样外观,培养瓶底面被80%左右的细胞铺满。经一次传代后,细胞贴壁速度明显加快,匀称分布,当细胞长满,再次传代;据我们观察在3代以内,软骨细胞增殖速率快,在此以后,髁突软骨细胞呈长梭形,出现“去极化”现象,生长速度明显变缓。胞浆内可见有棕黄色颗粒和红色荧光颗粒经Ⅱ型胶原免疫细胞化学和细胞免疫荧光染色。(2) 10ng/ml IL-1β降低髁突软骨细胞Ⅱ型胶原和AGG表达的效果最明显。(3)高压氧干预炎性髁突软骨细胞后,细胞增殖活性明显增高,collagen Ⅱ、AGG, p-PI3K 和 p-Akt表达水平明显升高;高压氧干预并加入PI3K抑制剂后,髁突软骨细胞增殖活性降低,collagen Ⅱ、AGG、p-PI3K和p-Akt表达水平下降。结论:高压氧通过PI3K/Akt通路促进炎性髁突软骨细胞表达细胞外基质、升高软骨细胞的增殖活性,为临床治疗TMJ-OA提供新方式。
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