研究目的原发性肝癌是一种高度恶性而在其进展期尚缺乏多样化治疗选择的常见肿瘤,肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要类型,也是全世界最高发的恶性肿瘤之一。HCC的发生、发展和侵袭转移是长期的、复杂的、多因素相互作用、共同参与的连续过程,因其发展过程中多基因参与、多步骤演变的复杂性,故其具体分子机制尚待进一步阐明。我国是肝癌的高发区,特别是乙型肝炎病毒所致的肝癌病人众多,故有的放矢的针对性探讨乙肝病毒相关性HCC的发生发展机制显得意义尤为重要。目前,手术切除仍被认为是治疗HCC的首选方案,但由于其起病隐袭、恶性程度高、发展迅速以及术后易复发和转移的特点,使其总体疗效不尽人意。染色体端粒缩短、环境改变刺激、遗传流行病学影响、细胞内分子功能变化等综合因素作用下导致了恶性细胞克隆的选择,最终促使了肝癌的发生、发展。因此,探讨HCC细胞中新基因的活性及其在相关信号转导通路中的作用,将有助于阐明HCC发生发展机制并寻找有效的生物学靶向治疗手段。Musashi-2(MSI2)属于RNA结合蛋白musashi基因家族的成员之一,位于人染色体17q22,编码328个氨基酸多肽。MSI2与调控肿瘤干细胞有关,MSI2高表达能引起骨髓造血干细胞的恶性转化,促进白血病发生。国外有相关报道发现：MSI2基因与肺癌、前列腺癌、尿路上皮细胞肿瘤等实体肿瘤的发生也显示相关性。随着对肝脏生物学研究的不断深入,Wnt/β-catenin信号通路在肝癌进展中的重要性被越来越多的研究所证实,而β-catenin是经典的Wnt/β-catenin信号通路中一个最重要的下游效应分子。本课题组前期实验结果发现MSI2在乙肝病毒相关性肝癌的组织标本中表达上调,与β-catenin的表达模式具有相关性；由此,我们推测,MSI2基因可能参与了肝癌的发生、发展,有必要对其在肝癌细胞的作用机制进行深入的基础及临床研究加以阐明。基于此,我们拟对MSI2基因在肝癌中与Wnt/β-catenin信号通路的关系作进一步的深入研究,以期为阐明肝癌的发生机制提供新的理论依据并为下一步可能的基因治疗提供新的分子靶点。本文拟从以下三个方面进行研究：一：MSI2在HCC中的表达及临床病理学意义研究；二：MSI2在体外实验中对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究；三：MSI2在体内实验中对肝癌进展的影响及调控机制研究。研究方法一MSI2在HCC中的表达及临床病理学意义研究1应用Realtime PCR法在分子水平检测10例肝癌患者MSI2及β-catenin基因的表达,并进一步分析MSI2及β-catenin的表达趋势相关性。2应用免疫组织化学方法检测106例乙肝病毒相关性肝癌及癌旁硬化肝组织芯片中MSI2及β-catenin基因的表达,分析MSI2的表达变化与肝癌临床病理特征的相关性；分析MSI2与β-catenin的表达趋势相关性；建立COX风险比例回归模型,对肝癌侵袭、转移的多种危险因素行回归分析,并对肝癌患者总体生存及无瘤生存应用Kplan-meier法行生存分析,探讨MSI2的表达变化与肝癌患者预后的关系。二MSI2在体外实验中对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究1应用Realtime PCR法检测三种肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hep3B中MSI2基因的表达,筛选高表达MSI2基因的细胞系。2构建针对MSI2基因的shRNA干扰表达载体,MTT法检测不同shRNA干扰载体作用后的肝癌细胞增殖活性及细胞活力,筛选MSI2基因沉默最优的shRNA干扰表达载体。3将携带RNAi表达载体的重组质粒转染高表达MSI2基因的肝癌细胞系；应用软琼脂克隆形成实验检测不用组别肝癌细胞的克隆形成能力；应用划痕修复实验在不同时间点动态检测不同组别肝癌细胞的迁移距离；Transwell法检测不同组别肝癌细胞的穿膜细胞数；应用流式细胞仪检测不同组别肝癌细胞在不同细胞周期的凋亡分布以及对肝癌细胞周期变化的影响。4将携带RNAi表达载体的重组质粒转染高表达MSI2基因的肝癌细胞系;Western blot法及Realtime PCR法检测不同组别Wnt/β-catenin信号通路上重要开关分子β-catenin、LEF-1、TCF-4的活性变化。三MSI2在体内实验中对肝癌进展的影响及调控机制研究1选择4-6周龄的SPF级裸鼠为体内实验动物模型,应用分选的高表达MSI2基因的肝癌细胞系及转染RNAi-MSI2的细胞系行细胞培养扩增后建立肝癌的皮下移植瘤模型,不同时间点动态观察肿瘤大小、体积变化,绘制肿瘤生长曲线。2应用上述建立的肝癌移植瘤模型,4周后切取肿瘤,拍照并测量肿瘤体积、重量,HE染色后对肿瘤内肝癌细胞行病理分析；应用Western blot及Realtime PCR法检测肝癌移植瘤内Wnt/β-catenin信号通路上重要开关分子β-catenin、 TCF-4、LEF-1的活性变化。结果一MSI2在HCC中的表达及临床病理学意义研究1 MSI2表达上调与肝癌的进展及术后复发密切相关本课题组在前期研究中,对10例肝癌组织标本及癌旁组织在分子水平应用realtime PCR法检测了MSI2的表达,结果显示肝癌组织中MSI2的表达上调,明显高于癌旁组织中的表达强度,这提示MSI2可能与肝癌的生物学行为具有相关性；为了对其进一步深入详尽的研究,我们选取了106例乙肝病毒相关性肝细胞肝癌患者作为研究对象,对其组织标本处理后构建组织芯片,应用免疫组化方法在蛋白水平上进一步研究MSI2的表达与肝癌患者临床病理特征的关系,结果显示,MSI2在肝癌组织中表达明显上调,与患者年龄、性别、肿瘤包膜是否完整、血管内瘤栓及AFP水平无相关性,与肿瘤大小、分化程度、肿瘤分期、术后复发及血管浸润具有相关性；这提示MSI2表达上调与肝癌进展及术后复发密切相关。2 MSI2在肝癌的表达与β-catenin的表达具有相关性本课题组在前期的组织标本研究中同时在分子水平应用realtimePCR法检测了β-catenin的表达,结果显示β-catenin在肝癌组织中表达上调,遂进一步应用免疫组化方法对106例组织标本构建的组织芯片在蛋白水平上检测其表达,结果显示β-catenin在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,且与MSI2的表达具有相关性；我们遂推测：MSI2可能通过Wnt/β-catenin信号通路参与了肝癌的进展,为我们进行下一步研究奠定了基础。3 MSI2表达上调可预测肝癌术后患者不良预后为了进一步研究MSI2的表达与肝癌术后患者预后的关系,我们将肝癌患者的临床病理参数作为影响肝癌患者预后的风险因素,建立COX风险比例回归模型；分别以患者的无瘤生存率及总体生存率为研究终点,对各风险因素行单因素及多因素回归分析,结果显示：肿瘤大小、肿瘤分化程度及肿瘤有无癌栓是影响患者术后无瘤生存率的独立危险因素；肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤有无癌栓及MSI2表达上调是影响肝癌患者术后总体生存率的独立危险因素；这提示MSI2表达上调可预测肝癌患者不良预后,有可能成为评估肝癌患者总体生存率的新型分子标志物。二MSI2在体外实验中对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及机制研究1 MSI2在肝癌细胞系中高表达为了进一步研究MSI2对肝癌细胞恶性生物学行为的作用及机制,我们应用realtime PCR法检测了MSI2在SMMC-7721、Hep3B及HepG2三种不同细胞株中的表达强度,结果显示MSI2在三种细胞株均呈高表达,在SMMC-7721中表达强度最高,其次为Hep3B及HepG2;我们将选择肝癌细胞系SMMC-7721进行下一步的功能及机制研究,并选择Hep3B及HepG2进一步验证。2 MSI2可增加肝癌细胞增殖活性为了明确MSI2表达变化对肝癌细胞生长活力的影响,我们应用RNA干扰技术将MSI2表达沉默,MTT法动态观察不同组别肝癌细胞活性变化,结果显示：在48h及72h观察时,MSI2 si-RNA组肝癌细胞增殖活性减慢,但与Mock组及Control组无明显差异,在96h观察时,MSI2 si-RNA组肝癌细胞增殖活性与Mock组及Control组差异显著,细胞活力明显受到抑制；这说明MSI2可增加肝癌细胞增殖活性,为以后可能的基因治疗提供了理论依据。3 MSI2可促进肝癌细胞克隆形成为了探究MSI2的表达对肝癌细胞生长的影响,我们采用软琼脂克隆形成实验的方法检测了细胞增殖活性变化,结果发现MSI2 si-RNA组肝癌细胞克隆形成数量与Mock组及Control组差异显著,细胞增殖活性明显下降；这进一步验证了前述的实验结果,MSI2表达下调可降低肝癌细胞增殖活性。4 MSI2可提高肝癌细胞迁移、侵袭能力为了进一步阐明MSI2对肝癌进展的作用,我们采用划痕修复实验检测了肝癌细胞系SMMC-7721不同组别肝癌细胞迁移能力的变化,结果显示,MSI2 si-RNA组肝癌细胞迁移距离与Mock组及Control组差异显著,细胞迁移能力明显下降；同时,我们采用Tranwell实验检测了肝癌细胞系SMMC-7721不同组别肝癌细胞侵袭能力的变化,结果显示,MSI2 si-RNA组肝癌细胞的穿膜细胞数量较Mock组及Control组明显减少,细胞侵袭性能下降显著；这说明MSI2可通过提高肝癌细胞迁移、侵袭能力促进肝癌进展。5 MSI2可抑制肝癌细胞早期凋亡为了揭示MSI2与肝癌细胞凋亡的关系,我们应用Annexin　V及P工对肝癌细胞染色标记,采用流式细胞仪检测了肝癌细胞系SMMC-7721不同组别的凋亡细胞分布,结果显示MSI2 si-RNA组保持活力的肝癌细胞数较Mock组及Control组明显减少,而与之相反,MSI2 si-RNA组早期凋亡的肝癌细胞数较Mock组及Control组明显增加；这说明,MSI2的表达可抑制肝癌细胞早期凋亡,促进肝癌细胞的活性维持,与肝癌的侵袭转移密不可分。6 MSI2可改变肝癌细胞周期分布、促进细胞增殖为了研究MSI2对肝癌细胞周期的影响,我们采用流式细胞仪检测了肝癌细胞系SMMC-7721不同组别的细胞周期分布变化,结果发现MSI2 si-RNA组G1期细胞数较Mock组及Control组明显增加,而与之相反,MSI2 si-RNA组S期的肝癌细胞数较Mock组及Control组明显减少；这说明,抑制MSI2的表达可引起细胞周期阻滞,MSI2的表达可加快肝癌细胞DNA复制,促进细胞有丝分裂,从而提高肝癌细胞的增殖活性。7 MSI2可上调Wntβ-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性为了明确MSI2在肝癌侵袭转移中的调控机制,阐明MSI2对Wnt/β-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin LEF-1及TCF-4活性变化的影响,我们应用western blot技术在蛋白水平上检测了肝癌细胞系SMMC-7721不同组别的细胞中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性变化,结果显示,MSI2表达沉默后,Wnt/β-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达明显下调；为了进一步验证上述表达趋势的变化,我们进一步应用realtime PCR法在转录水平检测了肝癌细胞系SMMC-7721不同组别的细胞中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达,结果发现,MSI2表达沉默后,MSI2si-RNA组β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达较Mock组及Control组明显下调；转录及翻译水平均验证了NISI2对Wnt/β-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性影响；这说明MSI2可通过Wnt/β-catenin信号通路调控肝癌生物学行为、促进肝癌进展。三MSI2在体内实验中对肝癌进展的影响及调控机制研究1 MSI2在体内促进肿瘤生长为了进一步验证MSI2对肝癌的作用及机制,我们采用SPF级4-6周龄裸鼠构建肝癌皮下移植瘤模型,模拟人肝癌内环境,以力求最客观的验证上述实验结果；从绘制的肿瘤生长曲线中发现,MSI2 si-RNA组较Control组的肿瘤生长缓慢,但在最初10天内观察,两组肿瘤体积无明显差异,随时间进展,两组肿瘤体积出现显著差异；切取瘤体后测量肿瘤体积及重量发现,MSI2 si-RNA组与Control组肿瘤体积及重量差异显著；这说明MS 12可在体内促进肿瘤生长。2 bISI2可增加肝癌细胞异型性为了观察MSI2 si-RNA组及Control组皮下移植瘤的细胞形态变化,我们将两组切取的肿瘤行HE染色,观察大体病理发现,MSI2 si-RNA组肝癌细胞体积较小,细胞分化程度相对高,瘤体内可见少量间质成分分布,细胞的异型性小,并可见组织坏死；Control组肝癌细胞数量多,体积丰满,呈巢状分布,无明显间质成分可见,细胞核体积大、分化差,细胞异型性程度高；这从微观上说明MSI2可增加肝癌细胞异型性、提高肝癌恶性行为倾向。3 MSI2可在体内上调Wntβ-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性为了验证MSI2在体内对肝癌生长、进展的调控机制,进一步阐明MSI2对Wnt/ β-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4活性变化的影响,我们应用western blot技术在蛋白水平上检测了MSI2 si-RNA组及Control组裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性变化,结果发现,MSI2表达沉默后,Wnt/β-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达明显下调；我们进一步应用realtime PCR法在转录水平检测了MSI2 si-RNA组及Control组裸鼠皮下移植瘤中MSI2、β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达,结果显示,MSI2表达沉默后,MSI2 si-RNA组β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达较Control组明显下调；这在体内实验中进一步验证了MSI2对Wnt/β-catenin信号通路下游重要效应分子β-catenin、LEF-1及TCF-4的活性影响；这说明MSI2可在体内通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌进展。结论1 MSI2在乙肝病毒相关性肝癌中表达上调,与肝癌临床病理特征及术后复发相关,可预测肝癌不良预后。2 MSI2可通过促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭、抑制肝癌细胞早期凋亡及改变细胞周期调控肝癌恶性生物学行为。3-ISI2可上调β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达,可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌进展。创新性及意义1首次提出MSI2与乙肝病毒相关性肝癌的关系,MSI2表达上调与肝癌术后复发密切相关,体内外实验证实MSI2表达可促进肝癌生长、进展,为设计以MSI2为靶点的基因治疗提供了理论支撑及实验依据。2首次明确MSI2可通过促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭、抑制肝癌细胞早期凋亡及改变细胞周期调控肝癌恶性生物学行为,为MSI2在肝癌的功能及机制研究奠定了理论基础。3首次证实MSI2可上调β-catenin、LEF-1及TCF-4的表达活性,体内外实验验证了MSI2可通过Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌进展,为进一步研究MSI2在恶性肿瘤中的功能及分子机制指出了新的方向。局限性1 增加病例样本资料,对MSI2与临床资料的相关性进行更充分的研究,避免单中心偏倚。2 MSI2与细胞凋亡、周期的关系及相关机制需进一步研究阐明。