孤儿受体RORγt配体的发现及晶体结构的研究和昆虫Lynx的表达纯化

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维甲酸受体相关孤儿受体γt(RORγt)是Th17细胞分化重要的调控因子,在一些自身免疫疾病上扮演着重要的角色,抑制RORγt的转录调节活性是一种治疗Th17相关自身免疫疾病非常有效的方法,RORγt是治疗Th17相关自身免疫疾病的药物开发的重要靶点之一。在本课题中,我们使用荧光偏振的方法筛选获得了42个核受体RORγt高亲和的配体小分子,通过荧光素酶报告基因技术进一步获得了在细胞水平可调控RORγt转录活性并有效调节IL17A表达水平的化合物4个,其中化合物MT01C0201-A、MT04H2001能够较好地通过抑制IL17A的表达,而MT08A0801-A和MT08A1301能够促进IL17A的表达。MTT实验显示以上化合物(除了MT01C0201-A之外)对293T无明显细胞毒性。为了研究小分子化合物与核受体RORγt的具体结合模式,我们使用大肠埃希菌BL21(DE3)表达RORγt配体结合区域,通过使用镍离子金属螯合亲和层析的方法进行蛋白的纯化,通过更换表达载体,构建不同长度片段最终获得了纯度高于90%的目标蛋白,通过蛋白结晶条件的筛选共有四个不同条件长出了蛋白单晶,并在上海光源进行了X光衍射数据收集。  昆虫Lynx基因是Ly6超级家族的成员,对烟碱型乙酰胆碱受体具有一定的调控表达作用。而昆虫烟碱型乙酰胆碱受体是昆虫中枢神经系统中重要的神经递质受体,介导快速胆碱能传递,是新烟碱类杀虫剂的作用靶标。为了研究Lynx与烟碱型乙酰胆碱受体之间的关系,我们通过使用不同的载体和截短型进行进行基因的重组,然后进行蛋白的表达和纯化,并且在pET22b-cl2014(22-126)-BL21(DE3)的上清中得到含量很高的目的蛋白。遗憾的是,最终却没有得到蛋白晶体。
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