独蒜兰组织培养及其生物多样性的ISSR分析

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独蒜兰属是兰科植物十分重要的一个属,全属约有2弓种。我国约有16个种。独蒜兰一般为陆生、岩生或附生于从海拔1000米到4200米亚热带山区,主要以喜马拉雅区域为主。我国在野外收集独蒜兰种质资源主要为园艺需要,虽然小部分种类可以通过种子的萌发繁殖及驯化,但是大部分还是野外采集为主。大多数独蒜兰只有一个叶片,有皱褶,一般在冬季凋落,少有宿存。独蒜兰的花一般为粉红色,也有白色和黄色,但较少。萼片离生,唇瓣明显大于萼片,不裂或不明显3裂,基部上部边缘啮蚀状或撕裂状,上面具有2至数条纵皱褶片或沿脉具有流苏状毛。近几年,虽然有一些研究关于独蒜兰从萌发到形成小植株的报道,但是目前来讲,国内外还没有系统地进行独蒜兰属的离体繁殖、植株再生和分子方面的研究,本研究选择我国云南以及越南共13个独蒜兰品种,从细胞学和DNA分子角度,分析了它们的遗传多样性水平和遗传结构状况,对毛唇独蒜兰以及其他多个种的离体繁殖技术进行了研究,得出如下结论:1.以独蒜兰的原球茎切块作为外植体进行快速繁殖的研究,结果表明:在1/2MS培养基中,6-BAlmg/L时外植体诱导丛生芽的出芽率最高;在TH培养基中,NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L时外植体诱导丛生芽的出芽率最好,并且增殖倍数比1/2MS多。用于诱导丛生芽的原球茎切块大小应大于0.5×0.5×0.5cm3。原球茎切块在光照长度12小时/天、光照强度为800-1200lx以及温度25±2℃培养。秋花独蒜兰(Pleione maculate)在TH+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L下丛生芽诱导率为100%;毛唇独蒜兰a(Pleione hookeriana)相同培养基下的丛生芽诱导率为93%,在1/2MS+6-BA1mg/L下丛生芽的诱导率为80%;陈氏独蒜兰(Pleione chunii)在1/2MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L培养基下的丛生芽的诱导率位为75%;黄花独蒜兰(Pleione forrestii)在1/2MS+NAA1mg/L+6-BA0.2mg/L培养基的培养下丛生芽的诱导率都为100%;大花独蒜兰(Pleione grandiflora)在1/2MS+6-BA1mg/L下诱导率为60%;四川独蒜兰(Pleione limprichtii)在1/2MS+NAA0.2mg/L+6-BA1mg/L下诱导率为80%;耳瓣独蒜兰(Pleione aurita)在1/2MS+NAA0.2mg/L+6-BA2mg/L下丛生芽的诱导率为75%。培养基TH+NAA 0.1mg/L+6-BA0.5mg/L+土豆50g/L可作为继代培养基复壮丛生芽。在1/2MS培养基中,0.5mg/LNAA和0.5mg/L6-BA有利于独蒜兰的丛生芽的生根。同时通过对原球茎的进一步切割也有利于其本身的增殖,但切割方式上一刀切割原球茎的增殖率要高于两刀切割的增殖率。2.用ISSR分子标记技术对独蒜兰属种间共13个样以及同种不同个体间进行了PCR扩增。扩增结果为:从100个引物中筛选出5个扩增条带多,信号强,背景清晰的引物,分别是(AC)8T、(TG)8C、(CT)8RG等5个引物,除895和58R外其共同特征是C和A两个碱基的8个串联重复以及CT和TG两个碱基对的串联重复,说明独蒜兰属DNA分子中广泛存在着CA或AC以及CT或TG的串联重复序列。5个ISSR引物和引物58R对独蒜兰的13个种进行了PCR扩增,5个引物共得到265条扩增带,每个引物对于13个种的独蒜兰种共可扩增出37—97条多态性带,平均53条,DNA片断大小分布在200—1500bp之间。多样性分析结果为:独蒜兰同种不同个体间的扩增没有出现特异性条带,表明独蒜兰同种不同个体间具高度的遗传一致性;独蒜兰属13个种的扩增电泳图谱经POPGENE软件分析,表明毛唇独蒜兰b与美丽独蒜兰以及四川独蒜兰的距离最远,其次是四川独蒜兰和大花独蒜兰的距离,岩生独蒜兰与秋花独蒜兰和疣鞘独蒜兰有较低的相异系数,秋花独蒜兰和疣鞘独蒜兰的距离最小。UPGMA聚类结果显示,13种独蒜兰主要聚类分布为:秋花、疣鞘和岩生聚成一支,毛唇b和独蒜兰聚成一支,再与黄花、云南、毛唇a和大花独蒜兰聚成一大类;陈氏和耳瓣独蒜兰聚成一支,美丽和四川独蒜兰聚成一支,二者组成另一大类。与形态学观察上以春季开花和秋季开花的分类有相似之处,以ISSR为基础的UPGMA聚类结果与核糖体序列ITS的结果基本吻合,说明ISSR可以用于独蒜兰的分类研究。
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