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硒多糖作为一种有机硒化合物,兼有多糖与硒二者的活性,且其生物活性普遍高于多糖和硒,更易于为机体吸收和利用。硒多糖具有调节免疫、抗氧化、抗金属中毒、抗癌、和拮抗重金属等。然而,天然硒多糖远远不能满足需要,为了获得更多的硒多糖,可对天然多糖进行硒化修饰。多糖的硒化修饰方法目前报道的方法有硝酸-亚硒酸钠(NA-SS)法、冰醋酸-亚硒酸(GA-SA)法、冰醋酸-亚硒酸钠(GA-SS)法、二氯氧硒(SOC)法。本实验室前期通过系列试验,分别筛选出免疫增强活性较强的七种硒化多糖(硒化当归多糖sCAPS2、硒化山药多糖sDOP2、硒化党参多糖sCPPS5、硒化淫羊藿多糖sEPS5、硒化大蒜多糖sGPS6、硒化百合多糖sLP6和硒化白术多糖sAMP9),以及抗氧化活性较强的七种硒化多糖(硒化党参多糖sSCP1、硒化百合多糖sLP2、sCAPS2、sCCPS5、硒化枸杞多糖sLBP6、硒化白术多糖sAMP6和硒化淫羊藿多糖sEPS7)。本研究首先比较了多糖的四种修饰方法,确定了 NA-SS法为最佳方法;然后通过体内、体外试验分别进一步比较了以上七种硒化多糖的免疫增强活性和七种硒化多糖的抗氧化活性,分别筛选出免疫增强活性最强的SCCP5和抗氧化活性最强的硒化多糖sLBP6及其最佳剂量,并分别测定了 sCPPS5和sCAPS2对免疫相关细胞因子基因表达和MAPK信号通路蛋白表达的影响。本研究的目的,旨在研究多糖的硒化修饰方法,筛选出增强免疫活性和抗氧化活性最强的硒化多糖,并探讨其作用机理,为研制新型免疫增强剂和抗氧化剂提供理论依据。试验包括以下七个部分:试验Ⅰ多糖的四种硒化修饰方法的比较 首先用热水浸提醇沉法提取大蒜粗多糖,用三氯乙酸法去蛋白,过DEAE-52纤维素柱,冷冻干燥,得到纯化的大蒜多糖,分别用硝酸-亚硒酸钠(NA-SS)法、冰醋酸-亚硒酸(GA-SA)、冰醋酸-亚硒酸钠(GA-SS)法、二氯氧硒(SOC)法修饰,以硒化试剂与大蒜多糖的质量比、反应温度和反应时间三因素、三水平正交设计9种修饰条件,分别得到9个硒化大蒜多糖sGPS1～sGPS9,用红外光谱法鉴定其结构,测定产物的得率、硒含量和多糖含量,比较不同修饰方法对产物的硒得率和纯多糖得率的影响。结果表明,4种方法均能成功修饰大蒜多糖,NA-SS法修饰产物的硒得率最高,多糖得率较高,且经济简便,是最佳的多糖硒化修饰的方法。试验Ⅱ 七种硒化多糖体外增强免疫活性的比较 将前期筛选的7种硒化多糖sCAPS2、sDOP2、sCPPS5、sEPS5、sGPS6、sLP6 和 sAMP9 以及修饰试剂 Na2Se03 分别用R[MINI1640培养倍比稀释成11个浓度,加入到小鼠脾脏淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定其最大安全浓度;然后取安全范围内5各浓度的各硒化多糖单独或与PHA、LPS同时加入到小鼠脾脏淋巴细胞的培养体系中,同法测定淋巴细胞A570值和细胞增殖率。结果显示,单独加入时,各硒化多糖组分别有1～5个浓度组的A570值显著大于细胞对照组,sCAPS2、sCPPS5和sGPS6组的增殖率显著高于其它各组;与PHA同时加入时,各硒化多糖组分别有1～5个浓度组的A570值显著大于PHA对照组,sCPPS5组的增殖率最高,显著高于其它各组,其次为sCAPS2和sGPS6组;与LPS同时加入时,各硒化多糖组分别有1～5个浓度组的A570值显著大于LPS对照组,sCPPS5组的增殖率最高、显著高于其它各组,其次为sGPS6和sCAPS2组。以上结果表明,硒化修饰能显著提高多糖的免疫增强活性,并与糖含量、硒含量相关。综合评价,sCAPS2、sCPPS5 和 sGPS6 的活性较强。试验Ⅲ硒化当归多糖体内增强免疫活性的測定 试验1为验证七种硒化多糖的体外增强免疫活性,比较了 7种硒化多糖对小鼠免疫OVA效果的影响。6周龄ICR雌性小鼠200只随机均分为10组,除空白对照组外均用OVA进行免疫,2周后二免。在首次免疫的同时,7个硒化多糖组小鼠分别皮下注射0.1 mg·mL-1的sCAPS2、sDOP2、sCPPS5、sEPS5、sGPS6、sLP6、sAMP9 0.4 mL,硒化试剂对照组小鼠皮下注射 10 μg.mL-1的Na2SeO3 0.2 mL,免疫对照组和空白对照组小鼠分别皮下注射等量生理盐水,每天1次,连续3天。分别于首免后7、14、21、28 d采血,测定脾脏淋巴细胞增殖和血清IgG含量。结果表明,各多糖均有不同程度的增强免疫作用,sCCPS5、sCAPS2和sGPS6的作用较强。试验2为筛选增强免疫活性最强的硒化多糖及其最佳剂量,进一步比较了试验1筛选出的3个硒化多糖的3个剂量对小鼠免疫OVA效果的影响。6周龄ICR雌性小鼠220只随机均分为11组,除空白对照组外均用OVA进行免疫,2周后二免。在首次免疫的同时,9个硒化多糖组小鼠分别皮下注射0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1的sCAPS2、sCPPS5、sGPS6 0.4 mL,免疫对照组和空白对照组小鼠分别皮下注射等量生理盐水,每天1次,连续3天。分别于首免后7、14、21、28 d摘眼球采血,测定血清IgG、IgM、IL-2、IL-4和IFN-γ的含量。结果显示,9个硒化多糖组在各时间点的免疫球蛋白及细胞因子含量多显著高于免疫对照组,sCCPS5M多为最高。结果表明,它们均有较强的免疫增强活性,sCCPS5中剂量的活性最强。试验Ⅳ七种硒化多糖的体外抗氧化活性的比较 将前期筛选的7种硒化多糖sSCP1、sLP2、sCAPS2、sCCPS5、sLBP6、sAMP6和sEPS7以及修饰试剂Na2Se03分别用蒸馏水倍比稀释成5个浓度,測定了它们对DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基的清除能力。结果显示,在同一浓度下,7种硒化多糖的抗氧化能力均显著大于或大于Na2Se03,对羟自由基的平均清除率排序为sCAPS2>sLBP6>sCCPS5>sAMP6>sEPS7>sSCP1>sLP2>Na2Se03,对DPPH自由基的平均清除率排序为sCAPS2>sLBP6>sCCPS5>sAMP6>sSCP1>sEPS7>Na2Se03>sLP2,对ABTS 自由基的平均清除率排序为 sCAPS2>sLBP6>sAMP6>sCCPS5>sEPS7>sSCP1>sLP2>Na2Se03。结果表明,硒化多糖的体外抗氧化活性高于硒化修饰试剂Na2Se03,并与剂量呈正相关。综合比较,sCAPS2、sLBP6和sAMP6的抗氧化活性较强。试验Ⅴ七种硒化多糖体内抗氧化活性的比较 试验1为验证体外七种硒化多糖的体外抗氧化活性,比较了 7种硒化多糖的体内抗氧化活性。6周龄ICR雌性小鼠200只随机均分为10组,除空白对照组外均用OVA免疫,2周后二免。在首次免疫的同时,7个硒化多糖组小鼠分别皮下注射0.1 mg·mL-1的sSCP1、sCAPS2、sLP2、sCCPS5、sAMP6、sLBP6和sEPS7 0.4 mL,硒化试剂对照组小鼠皮下注射10μg·ml-1的Na2Se030.2mL,免疫对照组和空白对照组小鼠分别皮下注射等量生理盐水,每天1次,连续3天。分别于首免后7、14、21、28 d采血,测定测定血清T-AOC、GSH-Px、SOD和MDA的含量。结果表明,7个硒化多糖均能不同程度的提高小鼠的抗氧化功能,sCAPS2、sLBP6和sAMP6的活性较强。试验2为筛选抗氧化活性最好的硒化多糖及其最佳剂量,进一步比较了筛选出的3种硒化多糖3个剂量的抗氧化活性。6周龄ICR雌性小鼠220只随机均分为11组,除空白对照组外均用OVA免疫,2周后二免。在首次免疫的同时,9个硒化多糖组小鼠分别皮下注射 0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.15 mg·mL/1 的 sCAPS2、sAMP6和 sLBP60.4mL,免疫对照组和空白对照组小鼠分别皮下注射等量生理盐水,每天1次,连续3天。分别于首免后7、14、21、28 d摘眼球采血,測定血清T-AOC、GSH-Px、SOD和MDA的含量。结果显示,9个硒化多糖组在各时间点的T-AOC、GSH-Px和SOD的活性均高于或显著高于免疫对照组,MDA的含量均低于或显著低于免疫对照组,sLBP6H的作用最显著。结果表明,3种硒化多糖3个剂量均有较强的抗氧化活性,sLBP6高剂量的活性最强。试验Ⅵ 硒化党参多糖对小鼠脾淋巴细胞IL-2、IL-4和IFN-γ mRNA表达的影响为了探讨硒化多糖增强免疫的作用机理,测定了硒化党参多糖sCCPS5对小鼠脾脏淋巴细胞IL-2、IFN-γ的mRNA表达的影响,以未修饰的CPPS为对照。培养小鼠脾脏淋巴细胞,分别加入3种浓度(3.125、1.563、0.781 μg·mL-1)的sCPPS5和CPPS,培养44 h后收集细胞,提取总RNA,用荧光定量RT-PCR方法測定IL-2、IL-4和IFN-γ的mRNA的表达。结果显示,sCPPS5在3.125 μg·mL-1时IL-2 mRNA的表达显著强于未修饰的 CPPS;sCPPS5在 3.125 μg·mL-1 和 1.563 μg·mL-1 时 IL-4 mRNA 的表达显著强于未修饰的 CPPS。sCPPS5 在 3.125 μg·mL-1和 1.563μg·mL-1 时IFN-γ mRNA 的表达显著强于未修饰的CPPS。结果表明,sCCPS5能显著上调小鼠脾脏淋巴细胞IL-2、IFN-γ和IL-4 mRNA的表达,可能是硒化多糖增强免疫作用的机理之一。试验Ⅶ 硒化当归多糖的保肝作用和对MAPK信号通路蛋白表达的影响 为了探讨硒化多糖抗氧化的作用机理,测定了硒化当归多糖对四氯化碳诱导小鼠肝损伤的抵抗作用和MAPK信号通路蛋白表达的变化。6周龄ICR雌性小鼠64只随机分为8组,6个多糖组小鼠分别皮下注射3种剂量(0.05 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.15 mg·mL-1)的sCAPS2和CAPS 0.4 mL,正常对照组和模型对照组小鼠皮下注射等量的生理盐水,每天1次,连续7 d。末次给药2 h后,正常对照组小鼠腹腔注射橄榄油0.25 mL,其余各组注射0.3%的CCl4橄榄油溶液0.25 mL。24 h后,采集血液和肝脏样品,分别测定血清总蛋白(TP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的含量,以及肝匀浆中T-AOC、丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)和ROS的含量,观察肝脏的组织病理学变化,用Western blot方法測定肝组织中MAPK信号通路蛋白的表达量。结果显示,sCAPS2能显著降低血清ALT、AST和ALP的含量,显著降低肝匀浆中MDA和ROS的含量,提高SOD和T-AOC的活性,作用强于CAPS;模型对照组肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润严重,sCAPS2组肝组织接近正常;模型对照组肝脏的p-ERK、p-JNK、p-p38蛋白的相对表达量均显著高于正常对照组,sCAPS2组3个蛋白的表达量显著低于模型对照组,与正常对照组的差异不显著,p-ERK和p-p38的表达量也显著低于CAPS组。结果表明,sCAPS2有显著的保肝作用,作用强于CAPS,能够通过抑制MAPK信号通路蛋白的表达抵抗肝损伤,可能是硒化多糖抗氧化的作用机理之一。