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目的邻苯二甲酸酯(Phthalic Acid Esters, PAEs)暴露所带来的健康效应,尤其是对生殖系统的影响,已成为威胁人类身体健康和子孙后代生存繁衍的重要公共卫生问题,PAEs可能通过对睾丸间质细胞中P450scc、3β-HSD、P450c17的作用而影响雄性激素的合成和间质细胞分布的改变,进而影响下丘脑-垂体-睾丸轴,同时,导致间质细胞中存在的胰岛素样因子3(insulin-like factor3, Ins13)的表达降低,进而对睾丸的正常下降产生影响,上述表达的改变导致一系列发育障碍。邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)作为污染较严重、暴露水平较高的PAEs,本研究以睾酮合成途径为切入点,探讨DBP及其主要代谢产物邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate, MBP)、DEHP及其主要代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate, MEHP)对小鼠睾丸间质瘤细胞睾酮合成相关机制的影响,以期对PAEs生殖毒性的分子机制进行探索,为内分泌干扰物对人类潜在影响的研究提供科学依据。方法1.CCK-8法测定DBP、MBP、DEHP和MEHP对小鼠睾丸间质瘤MLTC-1细胞毒性,确定染毒剂量。体外培养MLTC-1细胞,分别加入不同浓度梯度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用24h后,以CCK-8法观察DBP、MBP、DEHP和MEHP对MLTC-1细胞存活率的影响,并确定染毒剂量。2.直接化学发光法测定细胞培养上清中的睾酮水平。体外培养MLTC-1细胞,分别加入不同浓度梯度的DBP、MBP、DEHP、MEHP,提取培养上清液,在天津医科大学总医院的实验室采用直接化学发光法测定睾酮含量,观察DBP、MBP、DEHP、MEHP对MLTC-1细胞分泌睾酮水平的影响。3.检测P450scc、3β-HSD、P450c17、INSL3mRNA的表达水平。体外培养MLTC-1细胞,分别以不同浓度的DBP、MBP、 DEHP和MEHP作用于细胞24h后,运用实时荧光定量PCR测定P450scc、3β-HSD、P450c17、INSL3mRNA表达水平的变化。4.蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测INSL3蛋白表达水平的变化。体外培养MLTC-1细胞,分别以不同浓度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用于细胞24h后,进行蛋白印迹法(Western Blot)测定INSL3蛋白表达水平的变化。5.流式细胞术检测MLTC-1细胞凋亡。体外培养MLTC-1细胞,分别以不同浓度的DBP、MBP、DEHP和MEHP作用24h后,进行流式细胞术检测MLTC-1细胞凋亡比例的变化情况。结果1.DBP、MBP、DEHP和MEHP分别作用24h后,与对照组相比,浓度为2000μmol/L的DBP、MBP组细胞活性显著下降(p<0.05),浓度为0.001、0.01mol/L的MBP组细胞活性显著增加(p<0.05),1000、100μmol-L的DEHP.MEHP组细胞活性显著降低(p<0.05)。根据检测结果确定DBP/MBP染毒剂量为：对照组(Oμmol/L).0.1、10、1000μmol/L; DEHP、MEHP染毒剂量为：对照组(0μmol/L)、0.001、0.1、10μmol/L。2.染毒24h后,在人绒毛膜促性腺激素(human Chorionic Gonadotropin, hCG)刺激状态下,细胞合成睾酮的水平均随着染毒剂量的增加表现为先增加后下降的趋势,与对照组比较,0.1μmol/L的MBP组睾酮水平明显升高,1000μmol/L的MBP组睾酮水平明显降低,差异有统计学意义1000μmol/L的DBP组睾酮水平明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);0.001μmol/L的DEHP组细胞睾酮水平显著升高(p<0.05);10μmol/L的MEHP组细胞睾酮水平降低,差异有显著性(p<0.05)。3.荧光定量PCR结果表明,DBP、MBP均能抑制P450scc、3β-HSD、P450c17mRNA表达,与对照组比较,除了0.1μmol/L的MBP处理组未见统计学差异,其他各组的差异都具有统计学意义(p<0.05)。0.001μmol/L的DEHP处理组,P450scc、3β-HSD、 P450c17mRNA表达水平与对照组相较都显著增加(p<0.05)。0.1μmol/L的DEHP处理组,3p-HSD、P450c17mRNA表达水平与对照组相较显著增加(p<0.05),0.001μmol/L的MEHP处理组,3β-HSD mRNA表达水平与对照组相较都显著增加(p<0.05)。4. DBP和MBP处理后INSL3mRNA表达水平受到抑制,并且随染毒剂量的升高逐渐下降,呈现出剂量依赖关系,而INSL3的蛋白表达水平在最低剂量组MBP(0.1μmol/L)显著高于对照组(p<0.05)；而对于DEHP和MEHP组,免疫印迹法(Western Blot)检测结果与RT-PCR结果基本一致,DEHP浓度为0.001μmol/L和0.1μmol/L时INSL3mRNA和蛋白表达与对照组相比都显著增加(p<0.05); MEHP浓度为0.001μmol/L时INSL3mRNA和蛋白表达高于对照组(p<0.05)。5.流式细胞术分析结果显示在暴露于DEHP后睾丸间质细胞凋亡的比例显著增加(p<0.05)。 MEHP处理组细胞凋亡的比例也有增加的趋势,且染毒浓度为0.1μmol/L时差异具有统计学意义(p<0.05)。结论1.低剂量的DBP、MBP、DEHP和MEHP能刺激MLTC-1细胞增殖活性,随浓度的增加,MLTC-1细胞活性逐渐降低。2. DBP、MBP组DEHP和MEHP低剂量刺激,高剂量抑制MLTC-1细胞睾酮合成水平。3.实验中DBP、MBP能降低睾酮合成相关酶基因的表达水平,并能抑制INSL3基因蛋白表达水平；染毒剂量相对较低的DEHP和MEHP对睾酮合成途径的相关酶基因和蛋白的表达具有促进作用。DBP、MBP组DEHP和MEHP对基因表达的影响与睾酮合成变化之间存在一定的因果关系。4. DEHP和MEHP诱导MLTC-1细胞凋亡比例增加。