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前期实验证明麻芥巴布膏“经皮治肺”的血药浓度虽低于口服给药组,但却有更好疗效,这可能是通过肺与皮肤之间特异的调节通路而实现的。TSLP是肺与皮肤炎症免疫的关键共性因子,其两种亚型lfTSLP与sfTSLP分别在促进炎症与抑制炎症反应方面起作用。基于此我们提出以下假说:麻芥巴布膏可能通过调节肺与皮肤sfTSLP/lfTSLP平衡,继而减轻Th2炎症,从而达到“经皮治肺”的良好疗效。目的1.揭示过敏性鼻炎状态下肺与皮肤sfTSLP/lfTSLP平衡的变化规律及联系。2.评价麻芥巴布膏在体内外对sfTSLP/lfTSLP平衡的影响,确证TSLP是麻芥巴布膏发挥“经皮治肺”疗效中的关键因子。3.通过探讨麻芥巴布膏是否通过调节sfTSLP/lfTSLP平衡影响上皮免疫系统发挥“经皮治肺”的效果,部分揭示“肺主皮毛”理论的现代生物学内涵。方法1.SPF级雌性6周龄C57BL/6J小鼠40只,体质量21-25g,适应性喂养3天,随机分为4组,每组10只:空白组(K),空白+sfTSLP预处理组(KS),模型组(M),模型+sfTSLP预处理组(MS)。基础致敏阶段,第0、7、14天模型组与模型+sfTSLP预处理组小鼠腹腔注射OVA基础致敏溶液,0.1ml/只,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠予以等体积PBS注射。激发致敏与给药阶段,第15-30天预处理组小鼠每次激发致敏前1h给予sfTSLP多肽溶液滴鼻处理,40μl/只,其他组不做处理。预处理1h后,模型组与模型+sfTSLP预处理组小鼠鼻内滴入OVA激发致敏溶液,40μL/只,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠予以等体积PBS滴鼻。第22、30天(激发致敏后7天、末次激发致敏)观察滴鼻1min内小鼠的挠鼻次数,并记录小鼠的一般状态。取小鼠鼻、肺组织做HE染色,ELISA法检测血清IgE,TSLP含量,RT-PCR法检测小鼠肺组织TSLP,TNF-α,IL-4,IL-5,IL-13 基因表达情况。2.普通级雌性4周龄新西兰大白兔4只,体质量2.3-2.5kg,适应性喂养3天,同一组2只。初次免疫用弗氏完全佐剂混合,加强免疫用弗氏不完全佐剂混合。每两周免疫一次,每只兔子免疫4个部位。初次免疫每个部位注射量为200μl,加强免疫每个部位注射量为100μl。三免、四免后耳静脉采血间接ELISA检测抗血清效价,抗血清纯化后Dot Blot检测其特异性。3.人支气管上皮细胞株16HBE细胞,用DMEM高糖培养基+10%胎牛血清(FBS)+1%青霉素-链霉素混合液培养,取对数生长期16HBE细胞,CCK8法检测不同浓度麻芥巴布膏水煎液对16HBE细胞活性的影响;经细胞计数后调整细胞浓度为1×106个/ml,按6孔板每孔2ml、12孔板每孔1ml接种。细胞接种12h后,镜下观察细胞已贴壁生长,则弃去原细胞培养液,按实验分组更换混合不同浓度OVA溶液或HDM溶液的细胞培养液,继续培养6-24h。RT-PCR法检测过敏性鼻炎细胞模型目的基因lfTSLP和sfTSLP 含量。结果1.模型+sfTSLP预处理组小鼠挠鼻次数明显少于模型组(P<0.01),一般活动状态也好于模型组;空白组和空白+sfTSLP预处理组未见明显异常。鼻粘膜HE染色模型+sfTSLP预处理组小鼠较之模型组有明显改善,未见有明显的鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮增厚和粘液腺体增生,仅见有周围组织轻度水肿和少许炎性细胞浸润,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠鼻黏膜组织生长状态正常;肺组织HE染色模型+sfTSLP预处理组小鼠较之模型组有明显改善,支气管粘膜上皮周围组织水肿明显减轻,炎细胞数量明显减少,偶尔可见有轻度充血红肿的肺泡,肺泡内可见少量以淋巴细胞为主的炎性细胞,空白组与空白+sfTSLP预处理组小鼠支气管粘膜上皮及肺泡组织状态正常。血清IgE及TSLP含量,肺组织TSLP、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-13基因表达结果显示,与空白组相比,模型组明显增高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,模型+sfTSLP预处理组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01),空白组与空白+sfTSLP预处理组差异无统计学意义。2.第一组免疫兔抗血清三免效价检测结果显示兔A抗血清效价在0K,兔B抗血清效价在0K;四免效价检测结果显示兔A抗血清效价在0K,兔B抗血清效价在0K。第二组免疫兔抗血清四免效价检测结果显示兔C血清效价在0K,兔D抗血清效价在0K,抗血清纯化后Dot Blot检测为阴性。3.当麻芥巴布膏水煎液浓度为1mg/ml时,16HBE细胞活性较正常组略有升高,差异具有统计学意义(P<0.01),该浓度下麻芥巴布膏水煎液具有促进细胞生长的作用,可用于后续麻芥巴布膏的治疗研究。ELISA试剂盒检测两种细胞模型上清液未能检测出TNF-α有效含量,多次RT-PCR检测均未能得出sfTSLP及lfTSLP基因表达的有效信号。结论1.sfTSLP对OVA诱导过敏性鼻炎小鼠支气管及鼻黏膜组织具有良好的保护作用,且sfTSLP对正常小鼠无明显作用。2.sfTSLP能够显著降低OVA诱导过敏性鼻炎小鼠Th2相关炎症因子含量,并减轻由TSLP(lfTSLP)介导的Th2型炎症反应。3.对lfTSLP多克隆抗体的制备和过敏性鼻炎细胞模型的建立进行了探索。