背景“肾精”是中医学特有的物质概念,是决定机体生长、发育、强壮、衰老、死亡的重要生命物质。“肾精通于脑”是中医学重要理论。“补肾益精健脑”是中医重要治疗法则,临床应用非常广泛。但“肾精”的物质基础和“补肾益精健脑”机制至今未明。因此,在试验研究中,“补肾益精健脑”药效评价的动物模型、方法、技术、指标等体系无法建立。本项目提出有关“肾精”的假说,并拟采用体内、体外、生理、病理、药物等多方面验证“肾精”的物质基础及作用机制。本项目的研究获得了重庆市卫生局重大项目(渝中医2010-1-4)、教育部博导基金(20110182110012)、国家自然科学基金面上项目(81473549)的资助。目的拟观察大鼠肾虚模型、神经细胞体外损伤模型与促红细胞生成素(EPO)的关系,以及观察外源性EPO和补肾经典方右归饮对上述模型的改善作用与EPO、EPOR的关系,验证“EPO可能是‘肾精’物质基础之一,EPO对大脑神经细胞的促进和保护作用可能是‘肾精通于脑’的生物学机制之一”的假说。方法1.右归饮煎剂主要成分含量测定：三种主要成分的含量测定方法的建立。马钱苷含量测定色谱条件：色谱柱(ODS C18柱),流动相：乙腈：水(15：85),流速(1 mL·mi-1)柱温(30℃),检测波长为240nm；肉桂醛含量检测条件：色谱柱(ODS C18柱),流动相(乙腈：水=35：65),流速(1 mL.min-1),柱温(300C),检测波长(290 nnm)；梓醇含量测定条件：色谱柱(ODS C18柱),流动相(乙腈：水=2：98),流速(1 mL·min-1),柱温(30℃),检测波长(210 nm)。2.肾虚大鼠脑组织EPO/EPOR变化及右归饮的改善作用研究：60只雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组、右归饮5.86g·kg-1组、11.7g·kg-1组、23.4g·kg-1组,每组12只。除对照组以外,其余各组大鼠按10mg·kg-1腹腔注射氢化可的松,连续14d,复制肾虚模型。第15天,对照组、模型组灌胃等体积的生理盐水,其余各组按设定的药物剂量进行灌胃,连续给药14d。末次给药4h后眼眶静脉取血检测生化指标以及促肾上腺皮质激素(ACTH)、睾酮(T)、T3、T4及促红细胞生成素(EPO)的含量。取大鼠胸腺、肾上腺、睾丸称重,计算脏器指数。取脑并分离出脑皮质区,蛋白印迹法检测促红细胞生成素(EPO)、促红细胞生成素受体(EPOR)、Bcl-2、Bax蛋白表达。3.D-半乳糖损伤对神经细胞EPO/EPOR的影响及右归饮的保护作用研究：将高分化的PC12细胞分为6组：空白对照组、D-Gal损伤模型组、EPO+D-Gal组、右归饮0.1mg·mL-1+D-Gal组；0.2mg·mL-1+D-Gal组；0.4mg·mL-1+D-Gal组。对照组给予含10%胎牛血清的DMEM培养基培养,模型组给予10g·L-1的D-Gal处理24h, EPO+D-Gal组给予5IU·mL-1的EPO和D-Gal(10g·L-1)同时处理24h,右归饮+D-Gal组分别采用3个剂量和D-Gal同时处理24h。上述各组细胞加药后于37℃,5%C02的培养箱中孵育24h后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,红细胞生成素ELISA试剂盒检测细胞上清液中EPO的含量,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测EPOR、EPO、Bax、Bcl-2等蛋白表达。结果1.右归饮煎剂主要成分含量测定结果右归饮煎剂中马钱苷含量为0.341 mg·g-1；肉桂醛含量为0.039 mg·g-1；和梓醇含量为0.026 mg·g-1。2.肾虚大鼠脑组织EPO/EPOR变化及右归饮的改善作用研究结果2.1肾虚大鼠血浆及脑组织EPO/EPOR显著低于正常 与对照组比较,模型组大鼠血浆中EPO含量显著性降低(P<0.05)；大鼠脑皮质区EPO、EPOR蛋白表达量显著降低(P<0.05)。2.2右归饮对肾虚大鼠血浆及脑组织EPO/EPOR降低具有显著改善作用与模型组比较,右归饮23.4 g·kg-1组、11.7g·kg-1组、5.86 g·kg-1组大鼠血浆中EPO含量均显著升高(P<0.05)；右归饮5.86g·kg-1组、11.7g·kg-1组大鼠大脑皮质中EPO和EPOR的表达水平均显著升高(P<0.05)；右归饮23.4g·kg-1组肾虚大鼠大脑皮质中的EPOR表达量显著升高(P<0.05),EPO有升高的趋势(P>0.05)。2.3右归饮对肾虚大鼠的虚弱状态具有显著改善作用(1)改善行为体征：4组大鼠给予氢化可的松后精神萎靡,毛色变暗散乱,且活动量明显减少,蜷缩扎堆,体重明显降低。药物组灌胃右归饮后,症状均有不同程度的改善,精神好转,毛色逐渐光泽,活动量增多,体重逐渐回升。(2)升高脏器指数：与对照组比较,模型组胸腺指数、肾上腺指数、睾丸指数均显著性降低(P<0.05),提示模型复制成功。与模型组比较,右归饮23.4g·kg-1组胸腺指数、睾丸指数、肾上腺指数显著升高(P<0.05)。右归饮5.86g·kg-1组、1.17 g·kg-1组胸腺指数、肾上腺指数、睾丸指数有升高的趋势(P>0.05)；(3)升高血液生化指标：与对照组比较,模型组RBC、HGB、PLT以及淋巴细胞数均显著降低(P<0.05),WBC有下降的趋势(P>0.05)。与模型组比较,右归饮23.4g·kg-1组、11.7g·kg-1组大鼠RBC、HGB、PLT以及淋巴细胞数均显著升高(P<0.05)。右归饮23.4g·kg-1组还有WBC显著升高(P<0.05)。右归饮5.86g·kg-1组仅有RBC显著升高(P<0.05)。(4)升高血浆ACTH、T、T3、T4含量：与对照组比较,模型组血浆中ACTH、T、T3显含量显著性降低(P<0.05)。与模型组比较,右归饮23.4 g·kg-1组ACTH、T、T3含量显著升高(P<0.05)；右归饮11.7 g-kg-1组、5.86 g·kg-1组T3的含量显著升高(P<0.05),ACTH、T和T4含量有升高趋势(P>0.05)。(5)升高大鼠脑皮质区抗凋亡蛋白／促凋亡蛋白比率(Bcl-2/Bax):与对照组比较,模型组大鼠脑皮质区抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下降(P<0.05),而促凋亡蛋白Bax表达水平显著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比率显著降低(P<0.05)。与模型组比较,右归饮5.86 g·kg-1组、11.7g·kg-1组、23.4g-kg-1组大鼠大脑皮质中抗凋亡蛋白Bcl-2含量显著升高,促凋亡蛋白Bax含量显著降低,Bcl-2/Bax比率均显著升高(P<0.05),提示右归饮具有抗肾虚大鼠脑皮质细胞凋亡的作用。3.D-半乳糖损伤对神经细胞EPO/EPOR的影响及外源性EPO、右归饮保护作用3.1 D-半乳糖损伤导致神经细胞EPO/EPOR显著降低 对照组神经细胞培养上清液中EPO含量为1.55 IU/L, EPO、EPOR蛋白表达量相对IOD分别为0.343、0.27。与对照组相比,D-半乳糖10g·L-1损伤模型组神经细胞上清液中EPO含量为1.45 IU/L, EPO、EPOR表达量相对IOD分别为0.141、0.137,均显著低于对照组(P<0.05)。3.2外源性EPO对D-半乳糖损伤的神经细胞具有显著促EPOR蛋白表达及细胞保护作用(1)促进细胞中EPOR蛋白表达：对照组细胞中EPOR蛋白相对IOD值为0.27。与对照组相比,D-半乳糖损伤模型组细胞中EPOR蛋白相对IOD为0.137,显著低于对照组(P<0.05)。与模型组相比,EPO+D-Gal组细胞中EPOR蛋白相对IOD为0.29,显著高于模型组(P<0.05)。提示外源性EPO能促进EPOR蛋白表达,有利于对损伤细胞的保护作用。(2)提高细胞存活率：对照组细胞存活率为100%,与对照组相比,D-半乳糖损伤模型组细胞的存活率显著降低至53.98±5.71%(P<0.05)。与模型组相比,EPO+D-Gal组细胞存活率显著提高到79.27±7.75%(P<0.05)。(3)降低细胞凋亡率：对照组细胞凋亡率为8.14±2.2%。与对照组比较,D-半乳糖损伤模型组细胞凋亡率显著升高至24.6±3.9%(P<0.05)。与模型组相比,EPO+D-Gal组细胞凋亡率11.7±2.4%显著低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白(Bcl-2/Bax)比率显著性下降为0.21(P<0.05)。与模型组比较,EPO+D-Gal组Bcl-2/Bax比率显著升高至2.76(P<0.05)。(4)促进细胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白表达：对照组细胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相对IOD值分别为0.347、0.318。与对照组相比,模型组细胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白相对IOD值分别为0.161、0.129,显著低于正常组(P<0.05)。与模型组比较,EPO+D-Gal组细胞中(p)Jak-2/(p)Akt蛋白相对IOD值分别为0.289、0.327,均显著高于模型组(P<0.05),提示外源性EPO能激活EPOR下游蛋白激酶的磷酸化,引起级联反应,激活抗凋亡信号通路,有利于对损伤细胞的保护。3.3右归饮对D-半乳糖损伤的神经细胞具有显著促EPO、EPOR分泌作用及细胞保护作用(1)促进EPO、EPOR分泌：与对照组相比,模型组细胞中EPO、EPOR表达均明显下降(P<0.05)；与模型组比较,右归饮0.1 mg·mL-1+D-Gal组、0.2mg·mL-1+D-Gal组细胞中的EPO、EPOR表达水平显著升高(P<0.05)；右归饮0.4mg·mL-1+D-Gal组细胞中EPO含量显著升高(P<0.05),EPOR无显著变化(P>0.05)。(2)提高细胞存活率： 与对照组相比,损伤模型组细胞的存活率显著降至53.98±5.71%(P<0.05)；与模型组相比,右归饮0.1mg·mL-1组、0.2mg·mL-1组、0.4mg·mL-1组细胞存活率分别是74.97±8.81%、76.21±5.28%、65.10±2.97%,均显著升高(P<0.05)。(3)降低细胞凋亡率：对照组细胞凋亡率为8.1±2.2%。与对照组比较,损伤模型组细胞凋亡率显著升高至24.6±3.9%(P<0.05)。与模型组相比,0.4mg·mL-1+D.Gal组、0.2mg·mL-1+D-Gal组细胞凋亡率分别为15.9±1.5%、14.3±1.7%,均显著低于模型组(P<0.05)。右归饮0.1mg·mL-1+D-Gal组细胞凋亡率为17.8±3.1%有降低趋势(P>0.05)。与对照组比较,模型组抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白(Bcl-2/Bax)比率显著性下降为0.21(P<0.05)。与模型组比较,右归饮3个剂量组Bcl-2、Bax比率均显著升高(P<0.05),分别达到2.43、1.41、0.94。(4)促进细胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白表达对照组细胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白分别为0.347、0.318。与对照组相比,模型组细胞中(p)Jak-2、(p)Akt蛋白分别为0.161、0.129,均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,右归饮0.2、0.4mg-mL-1+D-Gal两个剂量组细胞中(p)Jak-2蛋白水平均显著升高(P<0.05),分别为0.276、0.299; (p)Akt的表达显著升高(P<0.05),分别为0.299、0.308。右归饮0.1mg·mL-1+D-Gal组有升高(p)Jak-2、(p)Akt趋势为0.186,0.137(均P>0.05)。提示右归饮可能通过激活EPOR下游蛋白激酶的磷酸化级联,激活抗凋亡信号通路蛋白表达,对损伤的神经细胞产生保护作用。结论1.试验用药右归饮水煎剂的主要成分含量马钱苷0.341 mg·g"1,肉桂醛0.039mg·g"1,梓醇0.026 mg·g-1,质量可控。2.氢化可的松导致的大鼠肾虚模型,伴随着血浆EPO和脑组织EPO、EPOR蛋白量显著降低。3.D-半乳糖导致的神经细胞损伤,伴随着细胞EPO分泌量及细胞EPO、EPOR蛋白表达量显著降低。4.外源性EPO对D-半乳糖损伤的神经细胞具有显著保护作用,能提高细胞存活率,降低细胞凋亡率,并伴随着细胞中EPOR蛋白表达量显著升高。5.补肾经典方右归饮对肾虚大鼠的衰弱状态具有显著的改善作用,能改善衰弱行为体征,升高衰弱脏器指数,升高血液RBC、HGB、PLT及淋巴细胞数量,升高血浆ACTH、T、T3含量,升高大鼠大脑皮质抗凋亡蛋白／促凋亡蛋白比率(Bcl-2/Bax),并伴随着血浆及脑组织中EPO、EPOR的降低被显著逆转。6.补肾经典方右归饮对D-半乳糖损伤神经细胞具有显著保护作用,能提高细胞存活率,降低细胞凋亡率,并伴随着细胞EPO分泌量及EPO、EPOR蛋白量的降低被显著逆转。综上所述：促红细胞生成素及其受体(EPO/EPOR)降低,出现在大鼠肾虚模型的血液、脑组织,以及神经细胞体外损伤模型的上清液、细胞蛋白表达中；其升高出现在大鼠肾虚模型虚弱状态被改善和体外损伤神经细胞被保护状态下。