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真菌多糖是活性多糖中的重要种类,分离纯化自真菌子实体或菌丝体、发酵液的产物,具有促进机体免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、控制细胞分裂分化,延缓衰老等功能。寡糖素促进了多糖应用于植物保护。已明确寡糖素可诱导诱导植物抗性,被称为糖链植物疫苗。真菌多糖中除香菇多糖外对植物病毒抑制活性研究较少。植物病毒因具绝对内寄生性和系统侵染性防治难度大,可选择利用真菌多糖的免疫活性进行防治。但目前该方面研究主要集中于防御酶和防效等,抗病分子机理研究较少。本研究选择云芝多糖为药剂研究对象,选择植物病毒中最具代表性的烟草花叶病毒(TMV)为防治对象,设置本氏烟清水对照、喷云芝多糖、接TMV前24h喷施云芝多糖、接TMV、接TMV后24h喷施云芝多糖5个处理,3次重复,处理72h后混样提取RNA。利用转录组和small RNA测序研究云芝多糖对烟草花叶病毒(TMV)的抑制分子机制及药剂、植物、病毒之间的互作,期望解释云芝多糖抗植物病毒活性。全文的主要结果如下:1、通过真菌rDNA-ITS分子鉴定,秦岭菌株(IS385)ITS区序列长度740 bp,与NCBI中已知12种云芝菌种序列BLAST比对同源性均达99%,GC含量47.97%,确定该菌种为云芝秦岭菌株,丰富了大型真菌种质资源。2、通过转录组测序,本氏烟各处理样品共得到20.56Gb Clean Data,Q30碱基百分比均大于88.54%,GC含量44.04%。Clean Reads与本氏烟参考基因组比对效率从75.68%到85.92%,Uniq Mapped Ratio与参考基因组比对效率从71.21%到79.18%,新发掘出4万多个SNP位点,转换(62.5%)多于颠换(37.5%),多位于基因区,杂合型约占58%。新预测约31000个可变剪接事件,其中喷施云芝多糖(T02)与接TMV前24h喷云芝多糖(T03)相比差异不显著,但比清水对照(T01)多845个;接TMV(T04)与接TMV后24h喷施云芝多糖(T05)相比差异不显著,但比清水对照(T01)多3128个。共优化22,783个本氏烟基因结构,发掘出2,837个新基因,其中1522个获得注释。3、通过转录本定量分析,共获得10个差异基因表达集。与清水对照(T01)相比,接TMV后24h喷施云芝多糖(T05)、接TMV前24h喷施云芝多糖(T03)、接TMV(T04)、喷云芝多糖(T02)处理差异基因分别为5032、3124、1549和341种,说明云芝多糖在病毒胁迫时会调动本氏烟大量基因转录,免疫调节作用明显。通过对差异表达基因功能注释和富集,云芝多糖在寄主与病毒互作过程中具有明显的免疫调控活性,主要涉及核酶活性、光合作用和能量代谢、病毒诱导的基因沉默等,诱导抗坏血酸、苯丙素生物合成、芪类化合物,二芳基庚烷和姜酚生物合成、植物-病原菌相互作用、植物激素信号转导、基因沉默、参与基因沉默的miRNA合成等途径。预测了差异表达基因蛋白互作网络相关基因调控途径。4、通过small RNA测序,清水对照(S01)、喷云芝多糖(S02)和接TMV(S03)处理各样品的Clean Data均大于15.44 M,Q30均大于93%,统计样品间公共及特有的sRNA序列。利用miRDeep2软件检测分析到898种miRNA,其中已知miRNA 164种,新预测miRNA 654种,并进行了miRNA碱基偏好性、碱基编辑和家族分析。5、通过miRNA定量分析,分别筛选出清水对照(S01)与喷云芝多糖(S02)、清水对照(S01)与接TMV(S03)、喷云芝多糖(S02)与接TMV(S03)处理样品间差异表达的miRNA 41、60、74种。利用TargetFinder软件预测已知miRNA(104/164)和新预测miRNA(227/654)的靶基因数分别为263、666个,共913个靶基因,其中871个靶基因获得注释信息。通过对差异表达miRNA候选靶基因的富集分析,云芝多糖对植物的免疫调节功能主要集中在活性酶、辅基、氨基酸和核酸代谢、逆境响应、分子功能调控等方面。6、通过转录组和small RNA关联分析,统计清水对照(S01)与喷云芝多糖(S02)、清水对照(S01)与接TMV(S03)、喷云芝多糖(S02)与接TMV(S03)处理样品间比较组合差异基因的上、下调种类为9、21、18个;同样,统计差异miRNA的上、下调种类为29、25、38个。在本氏烟中可能存在已知的三种miRNA调控模式。利用Cytoscape软件可视化编辑生成mi RNA-mRNA调控网络,预测nta-mi R172、nta-miR156家族成员是基因表达调控的关键mi RNA。7、通过sRNA深度测序技术,利用bowtie软件将未匹配到宿主本氏烟基因组的sRNA(允许1 mismatch)与GenBank Virus RefSeq核酸数据库进行比对,初步鉴定出样品中感染病毒viral siRNA。利用velvet软件拼接出1650条contigs并分类、注释,证明检测到可能的18种病毒序列,比对条数≥5条的有13种病毒,其中烟草花叶病毒占66.55%(1098/1650)。比对到其它种病毒的contigs需要验证,其产生机制及原因值得重视。本研究证明云芝多糖可通过复杂的分子调控途径诱导本氏烟抗性基因抑制TMV侵染,丰富了真菌多糖抗植物病毒理论,为真菌多糖研发提供了依据。