【摘 要】
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牛支原体是引起牛支原体病的主要病原,能引起我国肉牛呼吸综合征、奶牛乳腺炎综合征和运输应激综合征的主要病原,发病时的临床症状主要表现为肺炎、乳腺炎和关节炎。牛支原体病的发生多在运输应激之后,并随着贩牛运输而将该病扩散至全国各地。出于预防和控制牛支原体病的目的,本实验室已经针对此进行研究,有望能研制出牛支原体弱毒活疫苗。但却缺乏能够有效鉴别牛支原体野毒株自然感染和疫苗株人工免疫的诊断方法,通过将牛支原
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31272587;31302111）; 现代农业（肉牛/牦牛）产业技术体系专项资金（CARS-38）; 全国农业科研杰出人才及牛病防治基础与技术创新团队资金
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牛支原体是引起牛支原体病的主要病原,能引起我国肉牛呼吸综合征、奶牛乳腺炎综合征和运输应激综合征的主要病原,发病时的临床症状主要表现为肺炎、乳腺炎和关节炎。牛支原体病的发生多在运输应激之后,并随着贩牛运输而将该病扩散至全国各地。出于预防和控制牛支原体病的目的,本实验室已经针对此进行研究,有望能研制出牛支原体弱毒活疫苗。但却缺乏能够有效鉴别牛支原体野毒株自然感染和疫苗株人工免疫的诊断方法,通过将牛支原体野毒株HB0801与疫苗株M.bovis-150株的基因组对比后发现,疫苗株M.bovis-150株上有一段14kb大小的基因缺失区。为了筛选能够有效进行鉴别诊断的靶蛋白,本研究将缺失区内的基因进行克隆表达及纯化,以重组蛋白建立间接ELISA方法检测自然感染血清和疫苗免疫血清,以筛选能够鉴别牛支原体野毒株感染和疫苗株免疫的牛支原体抗原,主要结果如下:1.成功克隆和表达了rMbovP722蛋白和rMbovP730蛋白2种缺失区蛋白以及rMbovP699蛋白,利用Western Blot方法,确定rMbovP730具有良好免疫原性,能鉴别野毒株感染和疫苗株免疫。2.制备了rMbovP730蛋白高亲合力多克隆抗体,其效价分别为2^11*100。3.使用rMbovP730蛋白抗血清进行Western Blot,证实疫苗株不表达rMbovP730蛋白;4.以rMbovP730为检测抗原,牛支原体野毒株HB0801株感染牛血清和牛支原体疫苗株M.bovis-150株免疫牛血清为一抗,用Western Blot和ELISA方法检测该蛋白的抗体反应,结果均显示rMbovP730蛋白能够有效区分野毒株感染和疫苗株免疫。5.以rMbovP730蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,优化确定了实验条件,利用该方法检测已知背景的牛血清,包括利用牛支原体全菌蛋白ELISA筛选出的117份牛支原体自然感染血清和本实验室疫苗免疫的44份牛免疫血清,确定该间接ELISA的阈值为0.395时,该方法的敏感性为98.3%,特异性为97.7%;利用非相关病原体的阳性血清证实该方法特异性好。综上所述,本研究鉴别了一种能区分野毒株感染和疫苗株免疫的特异性抗原,rMbovP730,建立了鉴别诊断方法,方法灵敏度和特异性均高,具有广阔的应用前景。
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