【摘 要】
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伪狂犬病（Pesudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pesudorabies Virus,PRV）引起的高致病性、高死亡率的烈性传染病,能使多种家养及野生动物感染,猪是PRV感染后唯一存活的动物,感染猪多存在持续感染现象。我国对PR的防控,主要使用的是PRV基因缺失疫苗,取到了一定的免疫效果,但2011年起,不少免疫猪场出现了PR流行,后经研究证实PRV出现了新的变异,导致传统疫苗免疫效果
【基金项目】
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西北农林科技大学广西金陵研究院基金（编号:2019-001）；
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伪狂犬病（Pesudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pesudorabies Virus,PRV）引起的高致病性、高死亡率的烈性传染病,能使多种家养及野生动物感染,猪是PRV感染后唯一存活的动物,感染猪多存在持续感染现象。我国对PR的防控,主要使用的是PRV基因缺失疫苗,取到了一定的免疫效果,但2011年起,不少免疫猪场出现了PR流行,后经研究证实PRV出现了新的变异,导致传统疫苗免疫效果下降,因此为有效防控PR,提升PR的免疫效果十分必要。GM-CSF是用于增强疫苗免疫效果使用最广泛的细胞因子,本研究尝试使用GM-CSF提升PR免疫效果,利用CRISPR/Cas9技术成功构建了PRV基因操作平台,将PRV TK基因敲除,替换为GM-CSF,构建了重组毒株PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+,并对其进行免疫效果评价,获得了如下结果:1.重组PRV TK-/eGFP+的构建构建靶向亲本PRV SX-10-2015 TK基因的sgRNA质粒;再通过overlap PCR扩增出TK基因的同源臂,构建重组质粒pUC19 TK-eGFP,将重组质粒与sgRNA质粒按照一定比例转染BHK-21细胞后,接种PRV,对表达eGFP的细胞克隆进行挑纯,获得重组PRV TK-/eGFP+。通过TCID50,测定病毒滴度为1?106.43TCID50/0.1 m L;绘制病毒生长曲线发现,PRV TK-/eGFP+和亲本毒株生长规律相似,但病毒滴度降低;小鼠致病性试验显示,PRV TK-/eGFP+对小鼠的致死率为20%,组织病理变化为肝脏轻微出血,肺间质略微增厚。2.重组PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+的构建构建重组质粒pUC19 TK-CMV-GM–CSF–eGFP,将重组质粒与sgRNA质粒按照一定比例转染BHK-21细胞后,接种PRV,对表达eGFP的细胞克隆进行挑纯,获得重组PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+。通过TCID50,测定病毒滴度为1?105.76TCID50/0.1 m L;绘制病毒生长曲线发现,PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+和亲本毒株生长规律相似,但病毒滴度明显降低;小鼠致病性试验显示,PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+对小鼠不产生致病性,组织无明显病变。3.重组PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+的免疫效果评价用PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+和PRV TK-/eGFP+对小鼠进行免疫,在免疫后每隔7天对小鼠进行采血,监测gE抗体水平的变化,发现PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+比PRV TK-/eGFP+产生更高水平的gE抗体。免疫后用1?10~5TCID50/0.1 m L和1?10~3TCID50/0.1m L的PRV进行攻毒感染,发现PRV TK-/eGFP+能对小鼠1?10~5TCID50/0.1 m L的PRV感染提供60%的保护,对1?10~3TCID50/0.1 m L的PRV感染提供100%保护,而PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+对小鼠1?10~5TCID50/0.1 m L和1?10~3TCID50/0.1 m L的PRV感染均能提供100%的保护。对攻毒第0、7、21天的小鼠进行解剖,制作病理切片,测定各组织中的病毒载量,以及脾脏中相关细胞因子的表达情况,病理切片显示,PRV TK-/eGFP+免疫后,1?10~5TCID50/0.1 m L的PRV感染仍能对小鼠产生轻微的致病性,对1?10~3TCID50/0.1 m L的PRV的感染无致病性,PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+对1?10~5TCID50/0.1 m L和1?10~3TCID50/0.1 m L的PRV感染均无致病性;病毒载量结果显示,免疫后的小鼠脑组织的病毒载量明显降低,在攻毒第7天,各组织中的病毒载量达到最大;细胞因子表达水平显示,GM-CSF能显著增强IFN-γ和IL-4的表达,对IL-6和TNF-α无明显增强作用。综上,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了PRV基因敲除平台,在此基础上构建了表达GM-CSF的重组PRV TK-/eGFP+/GM-CSF+,免疫结果显示,GM-CSF具有免疫增强的效果,具有开发为疫苗的潜力。
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