胃癌是世界范围内的恶性肿瘤,2020年胃癌的全世界发病率为第五位,有约108.9万例新发病例。目前已存在很多胃癌治疗之法,比如手术切除术、分子靶向治疗、免疫治疗、化疗和放射疗法等,但我国胃癌多为进展期,5年总体生存率为35.1%。白花丹醌属于1,4-萘醌类,是一类重要的醌类化合物。目前,已有研究表明,白花丹醌在肝癌、乳腺癌、前列腺癌方面具有较好的抗癌效果,但目前白花丹醌在对胃癌方面的抗癌效果和作用机制鲜有报道。肿瘤新生血管生成会加快癌症细胞生长、浸润和转移。大量的研究表明,胃癌的增殖、侵袭性与核因子kappa B（NF-κB）转录因子的活性有关,是肿瘤细胞发生发展的重要信号通路。因此,本研究选取NF-κB通路探讨白花丹醌对胃癌的作用和抑制其血管生成的机理。本研究通过胃癌细胞、HUVEC细胞实验和胃癌小鼠模型的动物实验探讨了白花丹醌对胃癌细胞增殖、迁移及其抗血管生成的影响,并通过TNF-a介导NF-κB途径分析白花丹醌抑制胃癌血管形成机理,为其成为新的抗胃癌药物提供了理论支持。第一部分 白花丹醌对胃癌新生血管生成的影响研究目的本部分研究主要进行细胞实验,通过CCK8,划痕和成管实验分析白花丹醌对胃癌细胞增殖和迁移的影响以及对HUVEC管腔结构形成能力的影响。给予不同剂量的白花丹醌处理,证明白花丹醌对胃癌的生物学行为和HUVEC成管能力具有剂量依赖性研究不同剂量白花丹醌对胃癌细胞的增殖及血管生成作用的影响。方法通过酶标仪分析白花丹醌处理前后胃癌细胞和HUVEC细胞增殖,通过划痕实验验证胃癌细胞和HUVEC的迁移情况,通过Matrigel胶培养HUVEC细胞并通过微观结构分析不同剂量的白花丹醌对管腔结构形成的影响,同时,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹研究各组细胞中血管生成相关蛋白VEGF和VEGFR2的基因和蛋白水平表达。结果1.实验组胃癌细胞的增殖能力低于空白对照组,随着白花丹醌剂量增加,细胞增殖能力逐渐降低（P＜0.05）;与空白组相比,不同剂量的白花丹醌药物处理24h能显著抑制HUVEC细胞的增殖（P＜0.01）,增加白花丹醌的药物剂量,细胞增值数量逐渐降低。同一剂量组的HUVEC细胞数量显著低于胃癌（SGC-7901）细胞。这表明白花丹醌能抑制胃癌细胞和HUVEC细胞的增殖,抑制作用与白花丹醌剂量相关,且同一剂量的白花丹醌对血管内皮细胞增殖的抑制作用强于对胃癌细胞增殖的抑制作用。2.胃癌细胞划痕实验48h后能看到不同剂量白花丹醌处理组的划痕修复能力弱于空白对照组,且随着白花丹醌处理剂量的增加,划痕修复能力逐渐减弱。在HUVEC细胞划痕后48h,不同剂量白花丹醌处理组的划痕修复能力显著弱于空白组,趋势与胃癌细胞相近。同时,与空白对照组相比,在白花丹醌各个剂量组中,可胃癌细胞和HUVEC细胞迁移能力均显著下降,且随着剂量的增加迁移距离越短。上述结果说明,白花丹醌可以显著抑制胃癌细胞和HUVEC的迁移能力,抑制作用与药物剂量相关,且通过划痕实验我们发现给予相同剂量的白花丹醌对HUVEC细胞的抑制作用要强于胃癌细胞。3.微观结构显示,对照组中的HUVEC能形成交联的血管网络结构,而白花丹醌处理后,HUVEC细胞则不能形成完整的管腔结构,部分位置个别的条索状结构也不会出现。同时,高剂量组白花丹醌处理组的管腔结构形成程度低于低剂量组。这说明,白花丹醌具有抗血管生成作用。4.在SGC-7901细胞中,白花丹醌对VEGF、VEGFR2的mRNA表达水平均有下调,而且随着白花丹醌处理剂量的增加,下调作用显著（P＜0.05）。Western blot结果显示,蛋白表达水平与mRNA表达水平趋势一致。以上说明,白花丹醌能抑制胃癌细胞中血管生成相关因子表达。5.在HUVEC细胞中,白花丹醌对VEGF和VEGFR2的基因和蛋白表达水平均显著下调,而且随着白花丹醌处理剂量的增加,VEGF和VEGFR2表达被进一步抑制（P＜0.05）。Western blot结果显示,蛋白表达水平与mRNA表达水平趋势一致。以上说明,白花丹醌能抑制HUVEC细胞中血管生成相关因子表达。结论1、白花丹醌能抑制胃癌细胞和HUVEC细胞的增殖和迁移能力。2、白花丹醌能抑制HUVEC细胞的血管生成作用。3、白花丹醌能下调胃癌细胞和HUVEC细胞中的VEGF、VEGFR-2的表达水平。第二部分白花丹醌对胃癌裸鼠移植瘤血管生成的影响研究目的:本部分通过皮下注射胃癌细胞构建小鼠移植瘤模型,采用宏观分析,ELISA免疫组化等手段,研究白花丹醌对肿瘤的生长和血管生成的抑制作用。方法:选取BALB/c小鼠,胃癌细胞SGC-7901皮下注射诱导建立胃癌小鼠模型,将BALB/c小鼠模型随机分为4组:模型组、低剂量白花丹醌组（2mg/kg）、中剂量白花丹醌组（4mg/kg）和高剂量白花丹醌组（6mg/kg）,6周后处死小鼠取出肿瘤,测量其体积和重量,并计算白花丹醌的抗肿瘤抑制率。同时采用免疫组化方法分析CD31养心表达,计算小鼠肿瘤组织的微血管密度（MVD）。采用ELISA试剂盒和免疫组化实验检测血清和肿瘤组织中VEGF和VEGFR2的含量。Westernblot 分析 NF-κbp-p65、NF-κB-p65、p-IKK、IKK、p-IKBα、IKBα水平。结果:1、与模型组比较,经白花丹醌给药的小鼠肿瘤体积和重量显著减小,与药物剂量呈相关性,说明白花丹醌对胃癌有抑制作用（p＜0.05）。高剂量组（6mg/kg）抑瘤率可达50.32%。2.ELISA测定结果表明,与模型组比较,不同剂量的白花丹醌血清VEGF、VEGFR2水平显著降低（p＜0.05）,且随着给药量增加,二者表达水平逐渐降低。以上结果表明,白花丹醌可有效降低血清中的VEGF和VEGFR2水平。3.显微镜观察免疫组化染色结果,发现模型组中阳性表达最明显,CD31表达棕色管数最多;白花丹醌低、中、高剂量组阳性表达呈逐渐减少的趋势,以上结果表明,白花丹醌可有效地抑制了裸鼠移植瘤新生血管生成。4.免疫组化结果显示,VEGF因子和VEGFR2因子模型组阳性因子表达最明显,而白花丹醌低、中、高剂量组阳性表达呈逐渐减少的趋势（p＜0.05）。以上结果说明,白花丹醌能降低VEGF因子和VEGFR2因子的表达,从而抑制血管内皮细胞的增殖。5.Western bolt结果显示,与模型组比较,白花丹醌中、高剂量组NF-κbp-p65/NF-κB-p65、p-IKK/IKK、p-IKBα/IKBα水平明显降低（p＜0.05）。这些蛋白以剂量依赖性的方式表达。结论:1、白花丹醌减缓裸鼠移植瘤生长速度。2、白花丹醌抑制裸鼠移植瘤血管生成,并可以降低NF-κB通路相关因子蛋白表达水平。第三部分 白花丹醌抑制胃癌血管生成的作用机制研究目的本部分研究通过选取TNF-α介导的NF-κB信号通路并通过通路中NF-κB p65、磷酸化IKK和IKBα的蛋白表达情况分析白花丹醌抑制胃癌血管生成的调控作用,并结合人源胃癌组织免疫组化分析NF-κB通路和VEGF、VEGFR2蛋白水平。方法选取4μM剂量白花丹醌处理TNF-α介导的HUVEC细胞进行共培养,并通过Matrigel分析管腔结构形成,通过蛋白免疫印迹分析NF-κB通路中NF-κB p65、磷酸化IKK和IKBα的蛋白表达,同时,通过免疫组化分析人源胃癌组织中NF-κB通路相关信号分子及VEGF和VEGFR-2表达。结果1.微观结构显示,对照组组中HUVECs成管能力强于其他组,而白花丹醌处理HUVEC细胞后,不能形成完整的管腔结构,并且部分位置不会出现条索状结构,说明白花丹醌可以抑制HUVEC细胞成管。2.Western blot结果显示,与对照组相比白花丹醌干预组的NF-κB p65、磷酸化的IKK和IKBα的蛋白表达显著下调（P＜0.05）,以上结果说明,白花丹醌能通过抑制NF-κB p65的活化及磷酸化的IKK和IKBα的蛋白从而有效阻断TNF-α介导的NF-κB通路。3.在胃癌组织中的NF-κB p65、磷酸化的IKK和IKBα及VEGF和VEGFR-2表达量均高于肿瘤旁正常组织,结合我们前面研究,说明NF-κB通路可能成为白花丹醌在人体内抑制胃癌的治疗靶点。结论1.白花丹醌通过抑制TNF-α介导的NF-κB p65活化、磷酸化IKK和Iκ Bα的表达,阻断NF-κB信号通路,影响内皮细胞成管能力。2.NF-κB通路相关因子（包括NF-κB p65、磷酸化IKK和I κ Bα）及血管生成因子VEGF和VEGFR-2在患者胃癌组织中呈高表达水平,结合前文的结论共同分析,认为该通路可能是白花丹醌在人体内抑制胃癌的一个有效作用靶点。