纳米药物因其在靶向给药、药物缓控释、提高难溶性药物与多肽药物的生物利用度、降低药物毒副作用等方面显示出的良好应用前景,而成为21世纪生物医学领域的重要发展方向。纳米药物的载体包括高分子纳米颗粒、脂质纳米颗粒、无机纳米颗粒、病毒类纳米颗粒等,其中以磷脂为主要骨架基元的脂质纳米药物(主要包括脂质体、实心脂质纳米粒、磷脂胶束和细胞分泌囊泡等)具有良好的稳定性、优异的载药量和生物相容性,是目前临床上最受认可的载药系统。为了加快脂质纳米药物的研发进程并保障临床应用的药效,必须对纳米颗粒的粒径及其分布、颗粒浓度、药物包封率、载药量、表面配体数量及其分布等物理、化学性状进行快速、准确的表征。由于脂质纳米药物具有高度的异质性,唯有在单颗粒水平对纳米药物进行快速地逐一分析,方可揭示因集权平均而被掩盖的个体差异,获得具有统计代表意义的性状分布特征。然而,脂质纳米颗粒粒径微小、结构脆弱,使得在单颗粒水平对其进行多参数定量检测极具挑战性。虽然冷冻透射电镜(cryo-TEM)能够最大程度地维持脂质纳米药物的原貌,清晰地揭示纳米颗粒的粒径及微观结构,但是存在样品制备繁琐、试样固定时纳米颗粒易团聚、测量速度慢、仪器设备极其昂贵等缺陷。而现有的其他商品化单颗粒表征技术在灵敏度、分辨率、分析速度或多参数表征等方面尚难以满足脂质纳米药物的表征需求。因此,发展一种快速、灵敏、高通量的单颗粒水平定量表征技术对于脂质纳米药物的研发和应用至关重要。流式细胞仪是一种对悬液中的细胞或细胞大小的颗粒进行快速分析或分选的单细胞检测技术,具有快速、多参数、定量检测等优点。然而,传统流式细胞仪由于检测灵敏度的限制,只能检测到粒径大于500 nm或荧光亮度大于200个荧光素分子的信号。而纳米药物载体颗粒的粒径一般小于200 nm,且折射率低,使得传统流式细胞仪在脂质纳米药物的检测方面难以发挥作用。结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术,我们课题组发展了超高灵敏流式检测技术(high sensitivity flow cytometry,HSFCM),在国际上首次实现了发光能力低于单分子荧光的单个纳米颗粒散射光信号的直接检测,将二氧化硅纳米颗粒和纳米金的散射光检出下限分别推进到24 nm和7 nm,荧光信号检测限达到3个Alexa Fluor 555荧光分子,灵敏度比传统流式细胞仪提升了 3-5个数量级。HSFCM通过对单个纳米颗粒散射光强度的直接检测实现颗粒粒径的高分辨表征,每分钟检测速率高达10000个颗粒,仅需数分钟即可获得透射电镜需要数小时才能得到测试结果。此外,通过对颗粒的荧光信号进行同时检测,可实现单个纳米颗粒生物化学性状的多参数定量表征以及各参数之间的相关性分析。基于HSFCM优异的分辨率、灵敏度、检测速度及多参数表征的能力,本论文建立了一种在单颗粒水平对多种脂质纳米药物进行快速分析的方法,实现了脂质纳米药物粒径、颗粒浓度、载药量、包封率、表面配体数量及密度的多参数定量表征,为脂质纳米药物的合成优化、质量控制和临床应用提供一种快速、高效、实用的表征方法。本论文主要包括以下几方面内容:第一章为文献综述。简要介绍纳米药物的研究背景和国际上常用的脂质纳米药物单颗粒表征技术,以及本论文的选题思路和研究内容。第二章为基于散射光检测的脂质纳米药物粒径表征。通过HSFCM卓越的灵敏度实现了对阿霉素脂质体散射光信号的测定,并以二氧化硅纳米颗粒作为标准球将散射光强度转换为对应的粒径分布。另外,通过讨论颗粒折射率对粒径表征结果的影响,我们还提出了通过瑞利散射定律对二氧化硅标准球散射光强度进行校正以提高粒径测定结果的准确性。最后,为了实现标准品和待测样折射率的完全匹配,我们制备了四个不同大小的阿霉素脂质体并通过冷冻透射电镜表征其准确粒径,以之作为标准品用于对其他阿霉素脂质体样品粒径的精确测定。第三章为基于散射光和荧光检测的脂质纳米药物多参数表征。通过HSFCM的散射光和荧光双参数同时检测能力,实现对了阿霉素脂质体内微弱自发荧光的测定,并据此实现了阿霉素脂质体载药比率、血清稳定性和颗粒浓度的定量表征。此外,分别通过荧光二氧化硅标准球和阿霉素脂质体标准品建立荧光强度与阿霉素含量之间的关系,实现了脂质体载药量的测定。最后,我们根据建立的方法实现了对商品化阿霉素脂质体Doxoves和gDoxil以及临床Ⅱ期基因纳米药物siRNA脂质纳米粒的多参数定量表征。第四章为靶向型脂质体的制备与表征。首先以叶酸脂质体作为模型建立了脂质体表面配体密度的定量表征方法,并以此考察脂质体与细胞结合的最佳配体密度。此外,还分析了不同制备方法及PEG层厚度对表面配体密度及其分布异质性的影响。最后,还将该方法应用于表征以转铁蛋白和单克隆抗体作为靶向基元的脂质纳米颗粒的表面配体含量,并建立了评估有效配体在脂质体表面总蛋白含量中所占比例的实验方法。第五章为总结与展望。总结本论文的研究内容,并对今后研究工作进行展望。