论文部分内容阅读
目的:骨是一种不断更新的组织,骨重建贯穿生命过程的始终。生理条件下,骨吸收与骨再生之间保持平衡状态。如果这种平衡被打破就会发生骨硬化症、骨质疏松症以及局灶性骨溶解等疾病。破骨细胞（osteoclast,OC）是肌体中最主要的骨吸收的效应细胞;多种炎性及非炎性的骨与关节的病变都与OC代谢异常有关。姜黄素（curcumin）是从姜黄中提取的有效成分,主要包括了姜黄素、去甲氧基姜黄素、去二甲氧基姜黄素3种活性成分。具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、清除自由基、抗微生物以及对心血管系统、消化系统等多方面药理作用。但姜黄素对破骨细胞的药理作用尚不清楚。本研究旨在探讨姜黄素对破骨细胞及破骨前驱细胞形成的抑制作用,为临床上治疗骨代谢性疾病提供新的药物方法:1全骨髓细胞系的培养:将一只4周龄SD雄性大鼠无菌状态下取其股骨及胫骨,去净骨表面的软组织,剪断长骨两骨垢端,暴露骨髓腔。用10ml注射器抽取a-MEM培养液10ml,自骨髓腔冲出细胞,至骨发白。吹打均匀后离心（2000转/分）,5分钟。加15%胎牛血清a-MEM培养液40ml,吹打混匀成细胞悬液,计算细胞数,配制成2×106/ml细胞悬液,加入1,25（OH）2D(3终浓度为10-8mol/l)和sRANKL（终浓度为20μg/ml）。将细胞悬液注入24孔培养板（0.5ml/孔）,在24孔培养板中添加入不同浓度的姜黄素,分别为0,2.5,5,10,20,50ug/ml。每个浓度设4孔（n=4）。第一组为对照组。然后放入5% CO2 37℃孵育箱中培养。第4天更换一次培养液,去掉3/5体积的旧培养液,换以同体积的含1,25（OH）2D3和sRANKL新培养液。培养至第7天时行TRAP染色,经倒置相差显微镜下计算TRAP染色阳性细胞数。2破骨前驱细胞的培养全骨髓细胞提取后,用Sephadex G10过滤除去骨髓间质细胞,搜集非附着性骨髓细胞,配制成2×106/ml细胞悬液,加入1,25（OH）2D3（终浓度为10-8mol/l）和sRANKL（终浓度为20μg/ml）。将细胞悬液注入24孔培养板（0.5ml/孔）,在24孔培养板中添加入不同浓度的姜黄素,分别为0,2.5,5,10,20,50ug/ml。每个浓度设4孔（n=4）。第一组为对照组。然后放入5%CO2 37℃孵育箱中培养。第4天更换一次培养液,去掉3/5体积的旧培养液,换以同体积的含1,25（OH）2D3和sRANKL新培养液。培养至第7天时行TRAP染色,经倒置相差显微镜下计算TRAP染色阳性细胞数。另外,培养至第7天时对破骨细胞及破骨前驱细胞行TRAP染色,倒置荧光显微镜下观察OC的形态,计算TRAP染色阳性细胞数（3核以上及单核）,观察姜黄素对OC及POC的抑制作用。结果:1全骨髓细胞培养TRAP染色阳性细胞的形态学特征:TRAP染色后,可见阳性细胞胞浆呈紫红色,有许多细长的伪足样突起,胞核多,胞浆丰富,胞浆内含许多空泡结构,胞核大、核仁清晰。2破骨前驱细胞培养TRAP染色阳性细胞的形态学特征:TRAP染色阳性细胞特征与全骨髓细胞培养的成熟破骨细胞相似,只是细胞体积较小,多呈单核,偶可见2核者,以类圆形和不规则多边形为主,有伪足。3全骨髓细胞培养阳性细胞计数结果在2.5,5,10,20μg/ml姜黄素组（实验组）, TRAP染色阳性的破骨细胞数分别为142±19.71、77±17.40、76±1.41和64.25±7.54,而50μg/ml姜黄素组细胞全部死亡。对照组TRAP染色阳性的破骨细胞数为125±16.02。浓度为5,10,20μg/ml姜黄素组阳性破骨细胞数与对照组比较明显减少（P<0.01）,而浓度2.5μg/ml姜黄素组与对照组之间无明显差别（P>0.05）。而且随姜黄素浓度（2.5,5,10,20,50μg/ml）升高,破骨细胞检出数随之减少。4破骨前驱细胞培养阳性细胞计数结果在2.5,5,10,20μg/ml姜黄素组（实验组）, TRAP染色阳性的破骨细胞数分别为679±138.67、491±75.49、449.25±80.67和321.5±49.82,而50μg/ml姜黄素组细胞全部死亡。对照组TRAP染色阳性的破骨细胞数为704±67.93。浓度为5,10,20μg/ml姜黄素组阳性破骨细胞数与对照组比较明显减少（P<0.01）,而浓度2.5μg/ml姜黄素组与对照组之间无明显差别（P>0.05）而且随姜黄素浓度（2.5,5,10,20,50μg/ml）升高,破骨细胞检出数随之减少。结论:1姜黄素对全骨髓细胞系的破骨细胞及破骨前驱细胞的形成,分化具有抑制作用。2其作用机理可能是直接作用于破骨细胞系列细胞,抑制其形成及分化。