高产蛋白酶米曲霉的诱变选育及培养条件优化

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蛋白酶是活细胞产生的生物催化剂,应用十分广泛;米曲霉具有丰富的蛋白酶系,是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会公布的安全微生物菌株之一,也是国内酱油等发酵食品生产的主要菌株。因此,提高米曲霉的蛋白酶活力对于发展轻工业、提高产品质量有重要意义。本论文利用米曲霉沪酿3.042为出发菌株,通过紫外诱变筛选出一株中性蛋白酶活力较高的菌株,命名为米曲霉UV-16。该菌株的遗传稳定性较好,并将出发菌株的中性蛋白酶活力由1996.5 U·g-1提高到2368.0 U·g-1,蛋白酶活力提高了18.6%。实验对米曲霉UV-16的酶系进行了研究,发现该突变株其他酶系基本没发生改变。实验研究了基质组分和发酵条件对米曲霉UV-16产中性蛋白酶的影响,通过单因素实验,我们确定了麸皮为碳源,豆粕为氮源,豆粕添加量20%,KNO3添加量0.8%,MgSO4添加量0.07%,Na2HPO4添加量0.14%,每10g培养基接种1×108个孢子,温度28℃,加水量为原料量的85%,发酵时间70h,pH自然,并且发现FeSO4对产酶有抑制作用。经过单因素实验,蛋白酶活提高到2707.8U·g-1,酶活力在诱变的基础上提高了14.3%。单因素实验后,对加水量、培养温度、培养时间、豆粕添加量、KNO3、MgSO4利用响应面分析法精确找出最优条件。通过PB实验,确定了培养时间和豆粕添加量为主要影响因素;通过最陡爬坡实验,找到了响应面实验的中心点;再通过中心组合实验,确定了最佳的培养条件:培养基加水量为87%,豆粕添加量23.37%,KNO3添加量0.7%,MgSO4添加量为0.08%,Na2HPO4添加量0.14%,每10g培养基接种1×108个孢子,培养温度为29℃,培养时间67h。米曲霉UV-16产中性蛋白酶的能力达到2824.9U·g-1,蛋白酶活力再次提高4.3%。将米曲霉UV-16用于酱油酿造过程,该菌株在制曲过程中繁殖能力强且不易染菌,制得的酱油没有异味,风味良好,成品酱油的氨基酸态氮比米曲霉沪酿3.042酿制的酱油提高了7.7%,其它指标均符合国家的理化指标。因此,本实验获得的米曲霉UV-16菌株适用于工业生产。
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