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肿瘤免疫治疗具有治疗多种类型肿瘤的潜力,且具有持久反应和低毒性,可实质性改善患者总生存期,是肿瘤有望治愈的一个开端。一系列免疫检查点抑制剂的发现为肿瘤治疗装备了新颖而强大的“武器”,它们可以通过封闭抗原呈递细胞和T细胞之间抑制信号通路的传递,重新恢复T细胞的免疫应答,对肿瘤细胞发动攻击和杀伤。其中,程序性死亡-1（PD-1）/程序性死亡配体1（PD-L1）是免疫治疗领域最有前景的靶点之一。作为免疫检查点抑制剂,尽管PD-1/PD-L1单克隆抗体已在各类肿瘤治疗领域彰显其优势,但抗体类药物存在诸多的限制,在肿瘤应答率等方面仍具巨大挑战,故而强调了当前开发小分子抑制剂的迫切性和必要性。然而,由于PD-1与PD-L1间的蛋白-蛋白相互作用（PPI）的典型特征,使得设计和开发临床有效的小分子药物极具挑战。利用虚拟筛选技术从大量已知的化合物中挑选特定靶标的潜在结合物,再进一步结合生物实验对筛选到的化合物进行活性验证已成为一种常规的新药研发策略。本论文利用分子对接的虚拟筛选方法,快速筛选出化合物进行一系列的实验验证,从分子水平,细胞水平到动物学水平系统评价苗头化合物的PD-L1靶向活性,并阐释其作用机制,层层展开PD-1/PD-L1小分子抑制剂的研究。第一部分,从Specs化合物数据库中筛选出能与h PD-L1蛋白相互作用且抑制PD-1/PD-L1相互作用的苗头化合物。首先,我们从h PD-L1与小分子配体复合物的晶体结构（PDB代码:5J89）出发,借助基于分子对接的虚拟筛选策略从Specs数据库中筛选到了93个化合物进入生物活性实验测定。应用表面等离子体共振（SPR）和均相时间分辨荧光（HTRF）实验,共鉴定出5个小分子化合物能在分子水平上与h PD-L1结合,并且能够有效抑制PD-1/PD-L1的相互作用,具有微摩尔水平的活性。其次,基于流式细胞术的抑制实验,我们发现化合物APBC（SPECS No.AG-690/11449006）和CBPA（SPECS No.AN-465/42833793）具有新颖的骨架结构,能够有效的抑制细胞膜表面PD-1/PD-L1相互作用。再次,我们通过荧光素酶实验和T细胞功能实验证实,APBC和CBPA均能通过抑制PD-1/PD-L1的相互作用,实现T淋巴细胞的重新激活,浓度梯度依赖性增强其释放细胞因子IFN-γ和TNF-α的能力,逆转PD-L1介导的T细胞免疫抑制作用。以上实验结果表明,APBC和CBPA可作为具有潜力的苗头化合物,其体内活性值得进行更深入的探索。第二部分,构建小鼠肿瘤模型研究苗头化合物在复杂生理条件下的抗肿瘤效果,并探讨苗头化合物的作用机理。首先,基于小鼠肿瘤模型,我们发现化合物APBC和CBPA在10mg/kg的剂量下均对不同组织类型肿瘤有良好的抑制作用。而后,转录组学分析发现APBC和CBPA可以降低肿瘤的有氧糖酵解代谢通路,并且显著提高了免疫相关信号通路。通过流式细胞术和免疫组化对小鼠脾脏T淋巴细胞亚群和细胞因子分泌进行检测,发现APBC可以显著提高脾脏CD3+CD4+,CD3+CD8+T淋巴亚群比例,并且提高脾脏T淋巴细胞分泌细胞因子穿孔素（Perforin）,TNF-α和IFN-γ的能力。但是CBPA对脾脏T淋巴细胞亚群分布和细胞因子的分泌无显著影响,这表明APBC能促进系统免疫,而CBPA不具有此作用。同时,流式分析和免疫组化结果显示,APBC和CBPA治疗可以显著促进肿瘤组织中CD4+和CD8+T细胞的浸润,并且诱使肿瘤微环境中细胞毒性因子包括颗粒酶B（Gzm B）和Perforin的水平显著增加。这些炎性细胞因子相互协调作用,可将更多的T细胞募集到肿瘤微环境中,从而形成拮抗肿瘤生长的正反馈回路。综上,这些结果表明了小分子化合物APBC和CBPA可通过阻断PD-1/PD-L1 PPI来重新激活肿瘤浸润T淋巴细胞,进而发挥有效的抗肿瘤活性。第三部分,对化合物APBC和CBPA的生物安全性和体内的代谢稳定性进行了初步考察,并通过分子动力学模拟探讨这两个苗头化合物与PD-L1的相互作用模式。细胞实验和体内血液生化指标检测证实APBC和CBPA均具有良好的生物安全性,治疗剂量和高剂量给药（50 mg/kg）均未引起明显的肝肾毒性,特别是APBC具有更好的生物安全性。APBC和CBPA的代谢特征显示,二者均具有很好的血浆稳定性,但APBC在体外人肝微粒体中代谢较快(T1/2=17.4 min),CBPA具有中等的肝微粒稳定性(T1/2=44.6 min)。这提示我们在后期对化合物APBC和CBPA结构优化的过程中,既要考虑提高原有活性,同时也需要封闭或修饰代谢位点,提高肝代谢稳定性。基于CYP450酶抑制实验的药物相互作用风险评估显示,APBC对人CYP1A2酶有较强的抑制作用,CBPA对CYP1A2,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6酶有较强的抑制作用,这提示在联合用药时,需要考虑到与其它以上述酶为代谢主通路的药物相互作用风险。最后,分子动力学模拟结果表明,APBC和CBPA可能通过PD-L1二聚体锁定模式,阻断PD-L1和PD-1相互作用表面发挥作用。范德华相互作用和静电相互作用是小分子和PD-L1蛋白二聚体相互作用的主要驱动力。此外,APBC与A链上的A121和D122形成了两个氢键相互作用,CBPA与B链上的Q66形成了一个氢键相互作用,氢键相互作用的多寡和强弱直接影响结合能力,这说明在后续的苗头化合物结构优化过程中适当的增加配体分子类似的氢键供体和受体,很有可能质的提高苗头化合物的活性。探讨我们苗头化合物的优势和仍存在的问题,将为我们后期针对不同的结合位点进行结构改造提供有益的线索和依据。综上所述,APBC和CBPA的发现丰富了PD-1/PD-L1小分子抑制剂的多样性,可作为具有潜力的苗头化合物进一步设计和开发PD-1/PD-L1通路的强效抑制剂,为免疫治疗药物研发奠定坚实的基础。