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多肽、蛋白等生物大分子由于分子量大、亲水性强很难被肌体摄取,另外其在到达靶部位之前易被体内相应的酶破坏,因此如何改善此类药物的吸收并提高其生物利用度始终是药剂学工作者关注的焦点。纳米粒是一种近年来被广为应用的递药系统,其作为多肽蛋白等生物大分子药物的载体进行口服给药,可减少消化道对药物的降解破坏,但其口服生物利用度有待进一步提高。穿膜肽(CPPs)是一类具有很强穿膜能力的短肽,生理条件下带正电荷,能够协助其携载的药物跨膜转运至细胞质和细胞核中。目前穿膜肽多是以形成物理复合物或共价修饰蛋白分子的形式促进蛋白类药物口服吸收,物理复合物主要是靠穿膜肽与蛋白药物间的静电结合,应用上受到药物电性的限制；共价修饰蛋白分子,可能会影响蛋白药物的生物活性,而且新构建的大分子在体内的药代动力学有待进一步探讨。本文设想将穿膜肽修饰在包载多肽蛋白类药物的纳米粒表面,有望改善此类药物的体内吸收,从而提高其口服生物利用度,并拓宽CPPs在药物递释领域的应用范围。本文旨在构建一种以穿膜肽修饰的蛋白类药物口服纳米递释系统。以胰岛素为模型药物,制备寡聚精氨酸(poly(arginie)8, R8)修饰的胰岛素纳米粒,分别利用纳米载体与其表面修饰的R8提高胰岛素在消化道内的稳定性及细胞摄取能力,从而改善胰岛素的口服生物利用度。天然存在的CPPs均由L-氨基酸构成,在体内容易被各种酶降解,D-构型CPPs对各种消化酶的耐受能力更强,本课题比较L/D-构型R8促进胰岛素纳米粒体内吸收的效果,为CPPs介导的多肽蛋白类药物口服递释系统的设计提供依据。本文第一部分完成了寡聚精氨酸修饰的聚乙二醇-乳酸/羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)纳米粒的构建与表征。采用固相多肽合成的方法制备目标短肽L/D-R8-5-羧基荧光素(L/D-R8-FAM)、L/D-R8-半胱氨酸(L/D-R8-Cys),经制备型HPLC纯化、质谱鉴定,结果表明所得产物为我们所需的目标多肽,且纯度>95%。通过复乳法制得的包载胰岛素的纳米粒(INS-NP)外观圆整,粒径均匀,平均粒径在180nm-200nm,包封率为(29.10±2.59)%,载药量为(5.05±0.50)%。经L/D-R8修饰后,INS-NP的Zeta电势发生急剧改变,从-34mV到15mV,这是因为中性条件下R8带有大量的正电荷,R8的引入使纳米粒表面Zeta电势发生了很大的改变。傅里叶转换红外光谱(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)分析结果证明NP表面成功地修饰上了R8。INS-NP在三种不同介质中的体外释放结果显示,在Kreb-Ringers (K-R)缓冲液中,胰岛素的释放比较缓慢,但在人工胃液中释放较快,在人工肠液中胰岛素的释放比人工胃液中略缓。对所制备的R8-INS-NP的冻干稳定性进行初步评价,结果显示INS-NP冻干时需加入3%蔗糖作为冻干保护剂,西林瓶包装的冻干品对高温、光照稳定性差,对高湿有一定耐受性,所以INS-NP需要在低温、避光的条件下贮存。本文第二部分利用Caco-2单层细胞模型评价R8和R8修饰NP的穿膜能力。细胞摄取实验证明R8自身具有很强的穿膜能力,将L/D-R8修饰在PLGA纳米粒表面(L/D-R8-NP)可以显著提高纳米粒的细胞摄取和转运能力,修饰R8后NP的摄取百分含量是未修饰NP的1.5倍左右,转运百分含量最高达未修饰NP的3.3倍。并且材料和制剂的细胞毒性低,对细胞间紧密连接的作用亦可逆。通过比较两种不同构型穿膜肽的作用,非天然构型的D-R8促进NP细胞摄取和转运的能力略优于L-构型R8。本文第三部分以血浆中胰岛素浓度和降糖效果为指标对INS-NP和R8-INS-(?)P在正常大鼠体内的药动学和药效学进行评价。大鼠在体回肠段给药实验结果显示20%修饰度INS-NP、L-R8-INS-NP、D-R8-INS-NP的相对生物利用度和药理生物利用度分别为1.24%、3.87%、10.31%和2.36%、3.96%、8.24%；50%修饰度INS-NP、L-R8-INS-MP、D-R8-INS-NP的相对生物利用度和药理生物利用度分别为3.12%、10.18%、13.91%和3.02%、7.56%、11.49%。数据显示R8的修饰使胰岛素纳米粒的血药浓度和降糖效果都有了显著性提高,并且随着纳米粒表面R8修饰比例增加效果更加明显。与L-构型R8相比,D-构型R8修饰的胰岛素纳米粒能更好的促进胰岛素的吸收。可能的原因是L-构型穿膜肽易被体内各种酶降解,D-构型穿膜肽具有较好的酶耐受性,在体内可避免酶解,保持穿膜活性。因此,D-构型穿膜肽在口服药物递释系统中具有更深远的应用意义。乳酸脱氢酶(LDH)泄露实验和回肠段病理切片结果表明寡聚精氨酸修饰的胰岛素纳米递释系统安全性良好。综上,本文通过体外细胞实验验证了穿膜肽寡聚精氨酸具有很强的入胞能力,将其修饰在纳米粒表面可以协助纳米粒入胞,大鼠在体回肠段给药实验结果表明R8修饰的INS-NP口服生物利用度有了显著性提高,并且此给药系统的安全性良好,上述结果为设计多肽蛋白类药物口服给药系统提供了新的思路。