一、研究背景食管癌是我国常见的恶性肿瘤,发病率在男性中位居第四位,其中鳞状细胞癌是主要的病理类型。随着医学水平的进步,也经过我国广大医务工作者的不懈努力,食管癌的发病率和死亡率有了明显改善。然而,虽经积极手术治疗,同时结合术前新辅助、术后辅助化疗,术前新辅助、术后辅助放疗及免疫生物治疗、中医中药等多种综合治疗方案,食管癌的五年生存率仍然维持在30%左右,30多年来没有明显增加,究其原因是肿瘤的转移和复发。相当一部分患者,就诊时肿瘤分期较低,治疗前也无明显转移证据,在行肿瘤根治术后却早期死于肿瘤的复发转移。这说明,存在用常规临床检验和组织病理学方法不能检出的癌细胞播散或隐性转移。目前常用的肿瘤检测方法包括影像检查及血液中相关肿瘤标记物检测。影像学检查只能发现生长到一定大小的肿瘤,如大于1cm的肿瘤,但等到影像学发现时往往已经失去了最佳治疗的机会。血液中相关肿瘤标记物是早期发现肿瘤的一种方法,比如不同的nRNA标记物、循环DNA标记物、循环肿瘤细胞端粒酶等,但这些标志物的特异性较差,易导致假阳性结果,难以提供精确的临床信息。而活体组织病理检查虽然是肿瘤诊断的金标准,但取得活体组织的方法创伤较大,也不能随时进行,无法很好的评价肿瘤的发生发展及复发转移。近年来,随着对循环肿瘤细胞研究的深入,人们发现了将循环肿瘤细胞作为一种微创、准确的方法来评价肿瘤复发转移具有广阔的应用前景。随着免疫磁珠、纳米免疫磁珠、多色荧光标记和生物细胞分选芯片等细胞分选技术、RT-PCR等分子技术的快速发展,从外周血分离、富集血液中的稀有细胞即循环肿瘤细胞成为可能。但循环肿瘤细胞分离、富集和鉴定的方法国际上尚无公认的标准,不同检测方法的结果差异也较大,一定程度上阻碍了循环肿瘤细胞的深入研究。虽然如此,很多基于不同方法的循环肿瘤细胞的研究报道都证实了循环肿瘤细胞可能与肿瘤复发、转移及预后相关,随时检测循环肿瘤细胞有助于评价患者的肿瘤进展情况,可以在出现症状、肿瘤播散前及时采取必要的治疗方案,最大限度地抑制肿瘤进展,同时,动态监测肿瘤不同治疗阶段循环肿瘤细胞的变化有助于评价治疗方案的有效性,据此随时调整治疗方案,选择最佳的个体化治疗方案,以提高肿瘤患者的治疗效果,延长生存时间,改善生活质量。因此,在目前的个体化治疗模式下,循环肿瘤细胞可以对个体化治疗方案的确定提供强有力的依据。现在,对实体瘤外周血循环肿瘤细胞的研究越来越受到人们的关注,对各种实体瘤的循环肿瘤细胞的研究日益深入,对乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤循环肿瘤细胞的研究较多,也取得了很多有意义的结果。而目前有关食管鳞癌循环肿瘤细胞的检测方法及临床意义的研究很少。二、目的本实验采用基于负性筛选策略的免疫荧光染色技术检测食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞,评价该方法检测食管鳞癌循环肿瘤细胞的效用,尝试建立一种简便、快速、高效的食管鳞癌循环肿瘤细胞检测方法,同时探讨食管鳞癌外周血中循环肿瘤细胞的检出水平的临床意义,分析术前血食管鳞癌循环肿瘤细胞数量与临床病理特征的相关关系,分析术前、术后血循环肿瘤细胞不同检出水平组的无展生存时间的差异,评估食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞与肿瘤进展程度的关系,为外周血CTCs作为食管鳞癌患者的预后评价提供证据。三、材料和方法1、材料采集海军总医院胸外科2009年4月-2010年8月收治的48例食管鳞癌患者的术前一天、术后七天的清晨空腹外周静脉血,共96例标本。患者纳入和排除标准：术前明确诊断的食管鳞癌初治患者,术前未行放化疗及其他抗肿瘤治疗,知情同意。回顾分析患者临床病理特征和随访资料,研究时限为术后34个月。无进展生存时间(Progression-free Survival, PFS)为手术后到肿瘤复发时间。详细记录患者的临床信息,包括性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤分化程度、肿瘤大小及侵犯程度、肿瘤分化程度、淋巴结转移状态、p-TNM分期、肿瘤复发时间、术前、术后CTCs数量。2、方法于术前一天、术后七天采集食管鳞癌患者清晨空腹外周静脉血7.5ml,24小时内富集肿瘤细胞。用红细胞裂解液去除食管鳞癌外周血样本中的红细胞,用Miltenyi免疫磁珠去除白细胞,富集上皮来源的稀有细胞,用免疫荧光染色技术鉴定循环肿瘤细胞。经过Mitineyi磁珠富集后,食管鳞癌患者外周血检出CK8/18/19角蛋白抗原阳性／CD45白细胞表面抗原阴性的上皮来源细胞,同时,可见CK8／18／19阴性／CD45阳性的白细胞。3、循环肿瘤细胞数量与临床病理意义的分析目前乳腺癌循环肿瘤细胞的研究较为成熟,FDA于2004年批准CellSearch系统用于检测乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞辅助疗效评价和预后判断,该系统研究证实,采用循环肿瘤细胞数量界定5来判断疗效及预后分析有临床意义。在其他实体肿瘤循环肿瘤细胞的研究中,也多选择3个或5个为阳性结果界定标准,如前列腺癌、结直肠癌循环肿瘤细胞数量阳性界定值为3。各种实体肿瘤循环肿瘤细胞研究也证实,相当比例患者外周血中并未检出循环肿瘤细胞,循环肿瘤细胞数量的分布呈偏态分布,不能直接用循环肿瘤细胞的数量作为肿瘤分期及复发转移的判断标准。国内外至今尚无食管癌循环肿瘤细胞数量阳性判定标准,本实验参考其他实体肿瘤循环肿瘤细胞研究,数量小于3个为检出阴性,大于等于3个为检出阳性。对食管鳞癌患者术前血循环肿瘤细胞与患者的临床病理特征进行统计学分析,包括性别、年龄、肿瘤位置、细胞分化程度、原发肿瘤侵犯程度、淋巴结转移状态及p-TNM分期。分别分析术前、术后血循环肿瘤细胞不同检出水平组的无展生存时间的差异。4、数据统计等级变量的相关分析采用Spearman相关分析；用χ2检验或Fisher确切概率法分析原发肿瘤侵犯程度、细胞分化程度、淋巴结转移状态、肿瘤TNM分期与CTCs检出水平之间的关系。采用Kaplan-Meier法分析病人的无进展生存时间,比较不同CTCs水平患者的中位无进展生存时间。用log-rank检验行组间无进展生存时间的比较。所有的统计分析用SPSS13.0统计软件完成,以P<0.05为具有显著性差异。四、结果1、经过Mitineyi磁珠富集后,食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞检出率为64.6%(31／48),中位数2(0-72)。术后外周血循环肿瘤细胞检出率相同,为64.6%(31／48),中位数2(0-36)。术前血循环肿瘤细胞检出阳性与细胞分化程度(R=0.431,P=0.002)、原发肿瘤侵犯程度(R=0.403,P=0.005)、淋巴结转移状态(R=0.339,P=0.019)及p-TNM分期(R=0.394,P=0.006)有显著相关关系。分化程度越低(χ2=9.636,P=0.008)、淋巴结转移越多(χ2=4.218,P=0.040)、p-TNM分期越晚(χ2=8.392,P=0.004),CTCs检出阳性率越高。2、术前组CTCs<3和CTCs≥3两组的中位无进展生存时间分别为20个月(95%可信区间17.134-22.866)和13个月(95%可信区间11.161-14.839),术后血CTCs<3和CTCs≥3两组的中位无进展生存时间为分别为20个月(95%可信区间16.763-23.237)和13个月(95%可信区间11.518-14.482)。术前、术后血循环肿瘤细胞检出阳性组的术后无进展生存时间较检出阴性组低,有显著统计学差异。(术前组χ2=9.403,P=0.002,术后组χ2=23.049,P=0.000)五、结论1、基于负性筛选策略的免疫荧光技术,可以有效分离、富集、鉴定食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞,检出率与其他实体肿瘤检出率相近。2、食管鳞癌患者术前血循环肿瘤细胞检出水平与肿瘤分化程度、原发肿瘤侵犯程度、淋巴结转移状态、p-TNM分期有显著相关关系,与患者性别、年龄、肿瘤的位置无显著相关关系。3、食管鳞癌患者血循环肿瘤细胞检出阳性组较循环肿瘤细胞检出阴性组无进展生存时间显著降低。4、食管鳞癌患者外周血循环肿瘤细胞的检出水平可以反应肿瘤的进展程度,可以作为食管鳞癌患者的预后评价指标之一。