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井冈霉烯胺是合成II型糖尿病药物(伏格列波糖、阿卡波糖)重要的前体。目前常用的井冈霉烯胺生产方法包括化学合成和半生物合成,但是合成步骤繁琐、得率较低。开展微生物一步法生产井冈霉烯胺具有重要的研究意义。本实验室前期通过在吸水链霉菌5008中引入外源糖氨基转移酶BtrR,构建了β-井冈霉烯胺人工生物合成途径。本论文在此工作基础上,表征了其他候选糖氨基转移酶的催化性质,并建立高通量筛选方法对其进行分子改造。我们首先对糖氨基转移酶家族建立进化树分析,选取了VIa和VIb家族中具有晶体结构的8个糖氨基转移酶,同时还选取了与BtrR同属于VIg家族的4个糖氨基转移酶作为候选酶。分别将这些候选酶的基因克隆到表达载体中,进行蛋白表达纯化和活力测定。结果显示,ArnB_Sty和NtdA_Bsu催化井冈霉烯酮得到了外消旋产物;WbpE_Pae,StsC_Sgl和SpcS2_Ssp表现出了β-井冈霉烯胺的催化活力;来源于大肠杆菌的WecE表现出了光学纯井冈霉烯胺的催化活力,是潜在的井冈霉烯胺人工生物合成途径关键酶。因此我们选择WecE作为蛋白质工程改造的起始酶。我们针对WecE建立了糖氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法。我们依据氨基转移酶目标反应偶联L-谷氨酸脱氢酶信号指示反应,能消耗NADH引起340 nm处吸光值变化的性质,优化了偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间。确定了NADH起始浓度为0.4mM,L-谷氨酸脱氢酶偶联浓度为0.5 U/mL。该方法准确,灵敏,α-酮戊二酸最低检测限达到20μM。96孔板筛选结果显示,L-谷氨酸脱氢酶偶联筛选方法背景干扰较小,灵敏度高,可以有效区分催化活力提升的突变体。我们采用半理性设计手段,通过晶体结构分析、天然底物与非天然底物差异性比较和多重序列比对,选取了十八个氨基酸残基位点进行定点饱和突变建库。在五个位点(Lys223,Val318,Phe319,Tyr321,Ile322)筛选到了六个催化活性提高的突变体。其中Y321F的提升幅度最为明显,催化活力是野生型的4.4倍;V318Q和V318R次之,催化活性分别是野生型的3.6倍和3.9倍;F319V与K223I催化活力是野生型的2倍;I322A催化井冈霉烯酮生成了外消旋产物。将提高幅度最为明显的突变位点定向组合后,WecE的催化活力进一步提高。与野生型相比,Y321F/V318Q的催化活性提高了14.1倍,Y321F/V318R提高了12.9倍。分析突变位点在WecE晶体结构中的位置,我们发现Val318和Tyr321均位于核苷结合口袋Loop 9上,这表明组成WecE核苷结合口袋的Loop 9对WecE催化井冈霉烯酮的活力和立体选择性起到了重要的作用。分子动力学模拟结果显示,突变体与底物之间存在更多的相互作用稳定过渡态。本研究首次对糖氨基转移酶WecE建立了高通量筛选方法,并应用蛋白质工程手段提高其催化非天然底物的能力,为井冈霉烯胺一步法高效生产和糖氨基转移酶结构功能研究提供了新思路。