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研究背景和目的：肿瘤的有效治疗是医学领域最难攻克的难题之一。近年来，随着对免疫系统及其功能的深入研究，过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular transfer immunotherapy，ACT)成为继手术、化疗以及放疗等临床常规治疗方法外第4种肿瘤治疗的有效方式。ACT是指向肿瘤患者体内输注具备抗肿瘤活性的免疫细胞以激活机体抗瘤免疫应答或直接杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)在1991年由Schmidt-Wolf等发现，是脐血或外周血来源的单个核细胞在体外经一系列细胞因子刺激及诱导扩增得到的一群异质细胞，主要发挥杀瘤作用的是CD3+CD56+细胞。与早期用于ACT治疗的免疫细胞，如淋巴因子活化的杀伤细胞(lympokine activated killercells，LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes，TIL)、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)以及抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3monoclonal antibody activated killer cells，CD3AK)等相比，CIK细胞具备体外扩增效率高、抗瘤活性强、毒副反应小并且对多药耐药肿瘤细胞同样敏感等优点，已经在临床多种血液系统恶性肿瘤及恶性实体肿瘤的治疗中取得了可喜的效果，成为目前ACT治疗的研究热点。现在临床主要通过采集肿瘤患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcells，PBMC)行体外诱导收获CIK用于细胞过继治疗，但研究表明患者自体CIK细胞过继治疗对恶性实体肿瘤的总体有效性仅为30%左右；除患者自体CIK外，健康人来源的同种异体CIK细胞由于其易于获得、毒副作用小的特点被用于部分年老体弱患者的治疗，然而目前尚无关于肿瘤患者自体以及健康人CIK细胞在体外增殖能力、抑瘤活性以及临床治疗效果差异的系统比较。此外，CIK回输患者体内后在体内的存活周期也是影响ACT治疗效果的重要因素，但目前尚无关于此方面的确切文献报道。本实验的研究目的即是通过比较恶性肿瘤患者和健康人来源的CIK细胞在体外增殖能力、抑瘤活性以及临床治疗效果的差异，并初步分析健康异体CIK细胞回输患者体内后的存活时间，以期为临床实施CIK细胞过继治疗提供一定的依据和经验。方法：第一部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞的体外分离培养1． Ficoll密度梯度离心法分离肿瘤患者及健康人PBMC，在体外经干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、抗CD3单克隆抗体(OKT3monoclonal antibody，OKT3)、重组人白细胞介素-1(recombinant human interleukin-1，rhIL-1)以及重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)诱导培育CIK细胞；2．应用0.04%台盼兰拒染法计数培育3d、7d及14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞，分析体外增殖能力；3．应用流式细胞术检测培育3d、7d及14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞中CD3+CD56+表型变化。第二部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞体外抑制HCT116和HepG2并影响其Bcl-2/Bax表达的初步比较1．以人结肠癌细胞株HCT116和肝癌细胞株HepG2为靶细胞，设置效靶比(ratioof effector cells to target cells，E/T)为5:1、10:1、20:1和40:1，分别取培育14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞处理24h后通过细胞增殖、毒性检测试剂盒(cell countingkit-8，CCK-8)检测其对靶细胞的抑制活性，以正常PBMC处理的靶细胞为对照组；2．以人结肠癌细胞株HCT116和肝癌细胞株HepG2为靶细胞，设置效靶比为40:1，分别取培育14d时肿瘤患者CIK及健康人CIK细胞处理48h后通过Western Blot检测靶细胞中B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)以及Bcl-2相关X基因(Bcl-2associated X，Bax)表达情况并计算Bcl-2/Bax，以正常PBMC处理的靶细胞为对照组。第三部分：肿瘤患者接受自体或健康人CIK治疗后近期疗效比较以及健康男性CIK在女性患者体内存活周期的初步研究1．取患者接受自体或健康异体CIK细胞治疗后不同时间点外周血样本，通过流式细胞术检测淋巴细胞亚群水平，以健康人淋巴细胞亚群水平为对照；2．以Karnofsky功能状态评分(karnofsky performance status，KPS)、数字疼痛评分法(numerical rating scale，NRS)和体重变化作为主要评估指标，评估患者接受自体或健康异体CIK细胞治疗后临床收益反应(clinical benefit rate，CBR)；3．观察记录CIK治疗期间毒副反应，如发热、皮疹等不适；4．取8例接受男性亲属CIK细胞治疗女性不同时间点的外周血样本，提取DNA行常规PCR，对Y染色体性别决定基因(sex determining region of Y chromosome，Sry)行初步定性分析。结果：第一部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞的体外分离培养1．台盼兰拒染法结果显示培育3d、7d及14d时健康人CIK细胞增殖快于肿瘤患者CIK细胞；2．流式细胞术检测培育3d、7d及14d时CIK细胞CD3+CD56+表型变化，结果显示同时期健康人CIK细胞中CD3+CD56+比例高于肿瘤患者CIK细胞。第二部分：肿瘤患者自体及健康人CIK细胞体外抑制HCT116和HepG2并影响其Bcl-2/Bax表达的初步比较1．CCK-8检测肿瘤患者自体CIK细胞、健康人CIK细胞以及健康人PBMC对HCT116和HepG2的抑制能力，结果显示这3组细胞均可不同程度抑制肿瘤细胞，在同一种效应细胞作用时，效应细胞的抑瘤作用随效靶比的升高而增加；在同一效靶比下，健康人CIK细胞的体外抑瘤活性要强于肿瘤患者自体CIK细胞，而正常PBMC的抑瘤作用相对较弱；2．Western Blot检测肿瘤患者自体CIK细胞、健康人CIK细胞以及健康人PBMC处理后HCT116和HepG2中Bcl-2及Bax表达情况，结果显示这3组细胞处理后的肿瘤细胞Bcl-2、Bax表达情况均有改变，Bax表达不同程度上调，Bcl-2表达不同程度下调，Bcl-2/Bax比值呈现降低趋势，其中健康人CIK细胞引起的这一效应最强，正常PBMC处理组相对较弱，而肿瘤患者自体CIK处理组介于2者之间。第三部分：肿瘤患者接受自体或健康人CIK治疗后近期疗效比较以及健康男性CIK在女性患者体内存活周期的初步研究1．流式细胞术检测患者接受CIK细胞治疗后淋巴细胞亚群水平，以健康人淋巴细胞亚群水平为对照，结果显示CIK细胞过继治疗后24例患者免疫功能均有不同程度改善，其中健康异体CIK细胞治疗组12例患者总CD3+T、CD4+/CD8+比值改善较自体CIK细胞治疗组更快且持续时间较长；2．接受自体CIK细胞或健康异体CIK细胞治疗后60d的2组患者在KPS评分、NRS评分和体重变化这3个主要评估指标以及总体的CBR上无明显差异；3．观察期间24例患者均未出现严重的毒副反应；4．接受男性亲属CIK治疗的8例女性患者在治疗后均可检测到Sry基因条带，其强弱随时间逐渐减弱直至消逝，平均持续时间为(7.0±0.93) w。结论：本课题初步探讨了12例恶性肿瘤患者自体及12例健康人来源的CIK细胞在体外增殖能力、抑瘤活性及临床近期疗效的差异，并通过对8例接受男性亲属CIK治疗的女性患者外周血Sry基因水平行初步定性分析以评估CIK细胞在患者外周血的存活时间：一、在体外培育过程中，健康人CIK细胞较肿瘤患者CIK细胞增殖速度快且CD3+CD56+比例较高；二、肿瘤患者自体CIK细胞、健康人CIK细胞以及健康人PBMC在体外均可不同程度抑制HCT116和HepG2，其中健康人CIK细胞抑瘤活性较肿瘤患者自体CIK细胞强，而健康人PBMC抑瘤活性相对较弱；进一步实验表明，这3组细胞均可通过上调肿瘤细胞Bax、抑制其Bcl-2表达水平介导靶细胞的凋亡，其中健康人CIK细胞作用最强，肿瘤患者自体CIK细胞次之，健康人PBMC作用相对较弱；三、接受CIK细胞过继治疗后，24例患者免疫功能均有不同程度改善，其中健康异体CIK细胞治疗组免疫状况改善较自体CIK细胞治疗组更快且持续时间较长；2组患者在治疗后60d的KPS评分、NRS评分和体重变化以及总体的CBR上无明显差异，均未出现严重的毒副反应；其中接受男性亲属CIK治疗的8例女性患者在治疗后均可检测到Sry基因条带，其强弱随时间逐渐减弱直至消逝，平均可检出时间为治疗后(7.0±0.93) w。