论文部分内容阅读
桑葚是一种营养丰富的浆果，具有诸多生物活性。按照果实颜色分类，桑葚主要可分为黑桑葚和白桑葚。不同桑葚品种的营养成分具有较大差异，因此其生物活性也具有较大差异。本文首先采用HPLC等方法分析了黑桑葚和白桑葚的活性成分差异；通过ABTS法、DPPH法以及FRAP法比较了黑桑葚和白桑葚的抗氧化活性。氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate,EC）是食品发酵过程中的副产物，存在于多种发酵食品和饮料中。长期摄入含有EC的食品和饮料，会对人体健康产生危害。本实验室的前期研究发现，EC会引起人体的肝脏细胞发生氧化损伤。因此，本文建立了EC氧化损伤肝细胞模型，比较了两类桑葚是否能降低EC对肝细胞的氧化损伤。在此基础上，进一步分离得到黑桑葚中的关键活性成分矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside,C3G），并探究了C3G对于缓解EC引发的氧化损伤及其作用机理。
主要结果如下：
（1）黑桑葚和白桑葚醇提物的功效成分及抗氧化活性分析
本文分别选取了两种黑桑葚（“J33”、“天全”）和两种白桑葚（“珍珠白”、“小点红”）果实进行研究，制备得到黑桑葚和白桑葚醇提物样品，“J33”、“天全”、“珍珠白”和“小点红”分别命名为B1、B2、W1和W2。首先对桑葚中的总多酚、总黄酮和原花青素进行测定。结果表明，黑桑葚的总多酚、总黄酮和原花青素含量要远高于白桑葚。经过HPLC检测发现，黑桑葚中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芦丁、槲皮素和杨梅素的含量均高于白桑葚，二氢杨梅素仅在B2中有检测到。对于黑桑葚而言，B1中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量要高于B2，B1与B2中芦丁、槲皮素的含量相近。而在白桑葚W1和W2中，仅能检测到芦丁成分，且含量相近。进一步用ABTS法、DPPH法以及FRAP法探究黑桑葚和白桑葚的体外抗氧化能力。三种检测方法的结果均表明黑桑葚的抗氧化能力要优于白桑葚。B1的ABTS和DPPH自由基清除能力以及铁离子还原能力（FRAP）要高于B2。W1的ABTS自由基清除能力高于W2，但对于DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力（FRAP），W2要略好于W1。
（2）黑桑葚和白桑葚醇提物对EC诱导肝脏细胞（HepG2）损伤的保护作用
选取黑桑葚（J33，B1）和白桑葚（珍珠白，W1）醇提物进行后续实验。首先采用MTT法检测EC、黑桑葚和白桑葚对肝脏细胞HepG2的细胞活性影响。EC对HepG2细胞生长有显著抑制作用，60mM EC处理组细胞存活率分别为72.21%（对照组为100%）。0.25、0.5、1和2mg/mL黑桑葚和白桑葚醇提物对HepG2细胞存活率没有影响。1mg/mL和2mg/mL的B1预处理后，细胞存活率相比于EC处理组分别上升了为19.23%和26.39%，且与EC处理组具有显著差异；而W1预处理组不能显著提高细胞存活率。通过荧光显微技术分析，EC显著提高ROS水平至162%（对照组为100%），而2mg/mL的B1和W1分别降低荧光强度至114%和132%；此外，2mg/mL的B1和W1能够改善EC引起的细胞核损伤、线粒体膜电位下降、谷胱甘肽含量下降，但B1的预保护效果更加明显。富含花色苷等活性物质的黑桑葚对EC诱导的肝细胞损伤具有更好的保护作用。因此，推测黑桑葚中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷起主要活性作用。
（3）矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）对EC诱导肝脏细胞（HepG2）损伤的保护作用
基于上述研究，从黑桑葚中经乙醇提取、超声、大孔树脂吸附、洗脱和高速逆流色谱纯化，得到C3G纯品（HPLC≥97%）。单独毒性实验表明，5、10、25、50和100μM的C3G对HepG2细胞存活率没有影响，50μM的C3G预处理组的细胞存活率相对于EC处理组上升了14.4%。通过荧光显微技术分析，50μM的C3G能够显著降低EC引起的细胞损伤，50μM的C3G降低肝细胞内ROS至99%（EC处理组为181%，对照组为100%）；50μM的C3G分别降低肝细胞超氧阴离子含量至91%（EC处理组为129%，对照组为100%）；此外，50μM的C3G显著改善EC引发的肝细胞线粒体膜电位下降、谷胱甘肽含量下降。
综上所述，本文的研究结果科学分析了黑桑葚与白桑葚的酚类化合物成分差异和抗氧化能力，证实了桑葚对EC诱导的肝脏细胞氧化损伤具有较好的保护作用，进一步分离纯化得到关键活性成分花色苷C3G（HPLC≥97%）并探究其防护EC氧化损伤的功效与机理，为开发天然、安全以及功能性桑葚产品的选材提供了一定的科学依据。
主要结果如下：
（1）黑桑葚和白桑葚醇提物的功效成分及抗氧化活性分析
本文分别选取了两种黑桑葚（“J33”、“天全”）和两种白桑葚（“珍珠白”、“小点红”）果实进行研究，制备得到黑桑葚和白桑葚醇提物样品，“J33”、“天全”、“珍珠白”和“小点红”分别命名为B1、B2、W1和W2。首先对桑葚中的总多酚、总黄酮和原花青素进行测定。结果表明，黑桑葚的总多酚、总黄酮和原花青素含量要远高于白桑葚。经过HPLC检测发现，黑桑葚中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷、芦丁、槲皮素和杨梅素的含量均高于白桑葚，二氢杨梅素仅在B2中有检测到。对于黑桑葚而言，B1中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷的含量要高于B2，B1与B2中芦丁、槲皮素的含量相近。而在白桑葚W1和W2中，仅能检测到芦丁成分，且含量相近。进一步用ABTS法、DPPH法以及FRAP法探究黑桑葚和白桑葚的体外抗氧化能力。三种检测方法的结果均表明黑桑葚的抗氧化能力要优于白桑葚。B1的ABTS和DPPH自由基清除能力以及铁离子还原能力（FRAP）要高于B2。W1的ABTS自由基清除能力高于W2，但对于DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力（FRAP），W2要略好于W1。
（2）黑桑葚和白桑葚醇提物对EC诱导肝脏细胞（HepG2）损伤的保护作用
选取黑桑葚（J33，B1）和白桑葚（珍珠白，W1）醇提物进行后续实验。首先采用MTT法检测EC、黑桑葚和白桑葚对肝脏细胞HepG2的细胞活性影响。EC对HepG2细胞生长有显著抑制作用，60mM EC处理组细胞存活率分别为72.21%（对照组为100%）。0.25、0.5、1和2mg/mL黑桑葚和白桑葚醇提物对HepG2细胞存活率没有影响。1mg/mL和2mg/mL的B1预处理后，细胞存活率相比于EC处理组分别上升了为19.23%和26.39%，且与EC处理组具有显著差异；而W1预处理组不能显著提高细胞存活率。通过荧光显微技术分析，EC显著提高ROS水平至162%（对照组为100%），而2mg/mL的B1和W1分别降低荧光强度至114%和132%；此外，2mg/mL的B1和W1能够改善EC引起的细胞核损伤、线粒体膜电位下降、谷胱甘肽含量下降，但B1的预保护效果更加明显。富含花色苷等活性物质的黑桑葚对EC诱导的肝细胞损伤具有更好的保护作用。因此，推测黑桑葚中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷起主要活性作用。
（3）矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）对EC诱导肝脏细胞（HepG2）损伤的保护作用
基于上述研究，从黑桑葚中经乙醇提取、超声、大孔树脂吸附、洗脱和高速逆流色谱纯化，得到C3G纯品（HPLC≥97%）。单独毒性实验表明，5、10、25、50和100μM的C3G对HepG2细胞存活率没有影响，50μM的C3G预处理组的细胞存活率相对于EC处理组上升了14.4%。通过荧光显微技术分析，50μM的C3G能够显著降低EC引起的细胞损伤，50μM的C3G降低肝细胞内ROS至99%（EC处理组为181%，对照组为100%）；50μM的C3G分别降低肝细胞超氧阴离子含量至91%（EC处理组为129%，对照组为100%）；此外，50μM的C3G显著改善EC引发的肝细胞线粒体膜电位下降、谷胱甘肽含量下降。
综上所述，本文的研究结果科学分析了黑桑葚与白桑葚的酚类化合物成分差异和抗氧化能力，证实了桑葚对EC诱导的肝脏细胞氧化损伤具有较好的保护作用，进一步分离纯化得到关键活性成分花色苷C3G（HPLC≥97%）并探究其防护EC氧化损伤的功效与机理，为开发天然、安全以及功能性桑葚产品的选材提供了一定的科学依据。