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研究背景与目的过敏性哮喘是一种以肺部炎症、气道高反应性、粘液分泌过多和气道重塑为特征的复杂的呼吸道异质性疾病。在过敏性哮喘中,ILC2s在2型免疫反应的起始和进展阶段起到了十分关键的促进作用。当呼吸道受到抗原、寄生虫或病毒的刺激之后,受损的气道上皮细胞可以分泌IL-33、IL-25以及TSLP等“警报素”,这些细胞因子能够激活ILC2s产生IL-5、IL-13、IL-9等Th2型细胞因子,促使肺部嗜酸性粒细胞的浸润,气道黏液的分泌和气道平滑肌收缩。此外,ILC2s可以协调细胞反应网络,与多种类型的免疫细胞进行交互作用,促使肺损伤炎症反应和组织修复。Friedrich C.Luft等人通过动物研究发现,具有血栓素抑制特性的COX产物可以改善哮喘模型小鼠的哮喘症状,即COX产物能够抑制过敏原诱导的过敏性炎症反应;PGI2是花生四烯酸经COX途径的代谢产物,在肺部的来源主要是是血管内皮细胞,可通过G蛋白偶联受体IP发挥生物学效应。PGI2类似物伊洛前列素在临床一直被应用于治疗肺动脉高压;伊洛前列素作为COX产物类似物的一种,它是否可以扩展应用于过敏性气道炎症疾病的治疗?直到目前还未被认证。本课题组通过预实验发现伊洛前列素可以明显减轻由IL-33诱导的气道炎症模型小鼠的肺部炎症情况:如小气道及血管周围炎细胞浸润减轻,气道黏膜上皮杯状细胞增生及黏液分泌减少,肺组织、BALF中嗜酸性粒细胞和ILC2s含量减少等炎症减轻现象。初步证实了伊洛前列素能够明显改善肺部炎症情况。ILC2s与Th2型细胞具有相似功能,在气道炎症发生的早期阶段可受到“警报素”刺激,分泌大量Th2型细胞因子,被称作Th2的“镜像细胞”,是过敏性气道炎症早期Th2型细胞因子的主要来源。由于课题组前期已经在小鼠气道炎症模型中验证了伊洛前列素可以改善肺部及气道炎症情况,但还未有研究证实伊洛前列素可以抑制ILC2s的增殖及功能活化,根据预实验结果及查阅相关文献我们推测伊洛前列素可以通过G蛋白偶联受体IP,对ILC2s的功能也产生抑制作用,从而在炎症发生的早期发挥抑制炎症的作用。为了从细胞水平及分子水平验证研究设想,本研究拟选用退役(半年以上)C57BL/6J小鼠肺组织中分离出的ILC2s,在体外探究伊洛前列素对ILC2s的增殖及其分泌IL-5、IL-13的能力的影响,为哮喘的治疗提供新的治疗依据。方法1.体内预实验:选用6-8周雌性C57BL/6J小鼠,随机分为vehicle组、IL-33刺激组、IL-33+iloprost干预组、伊洛前列素对照组,采用IL-33滴鼻法建立小鼠气道炎症模型,HE染色观察肺组织中小气道及血管周围炎症浸润情况;PAS染色检测气道上皮杯状细胞增生及黏液分泌情况。2.体外实验:选取C57BL/6J退役雌鼠,密度梯度离心法结合磁珠分选法分离出肺组织中的Lineage-淋巴细胞,流式细胞术分选出lineage-KLRG-1+Sca-1+细胞,即ILC2s。将分选得到的ILC2s分为vehicle、IL-33、IL-33+伊洛前列素和单独伊洛前列素组。细胞计数检测不同组细胞数;IC检测ILC2s内Ki-67、GATA3、STAT5表达情况;3.分子实验:ELISA检测细胞培养72h后上清中IL-5、IL-13水平;实时荧光定量PCR检测ILC2s中IL-5、IL-13、GATA3、PPARγ的m RNA相对表达量。结果一、体内预实验结果1.HE和PAS染色结果经鼻滴入IL-33后,IL-33刺激组小鼠肺组织切片可见大量炎性细胞浸润、杯状细胞增生以及黏液分泌增加;使用伊洛前列素干预后小气道及血管周围炎细胞浸润明显减少,气道上皮杯状细胞增生情况减轻,黏液分泌减少。二、体外实验结果1.细胞计数结果对培养72h的ILC2s进行分组计数,结果发现IL-33刺激组(11170.41±2210.20个/孔)较vehicle(8334.46±2020.11个/孔)、单独伊洛前列素组(6972.57±850.13个/孔)细胞数明显增多(P<0.05),IL-33+伊洛前列素干预组(6972.57±850.13个/孔)细胞数目则较IL-33组明显减少(P<0.05)。2.IC结果对分组培养24h的ILC2s细胞进行胞内染色,检测核内磷酸化蛋白p STAT5水平,结果发现IL-33组p STAT5水平(MFI:4706.91±1343.11)明显较vehicle组(MFI:2051.63±794.10)、单独伊洛前列素组(MFI:2429.37±635.00)明显升高,而IL-33+伊洛前列素组p STAT5水平(MFI:2706.01±579.29)较IL-33组明显降低(P<0.05);对培养72h的ILC2s进行胞内染色检测转录因子GATA3表达量,研究结果趋势与p STAT5检测结果趋势相同;IL-33组GATA3水平(MFI:22120.60±5740.00)较vehicle组(MFI:14680.34±5631.11)、单独伊洛前列素组(MFI:11503±3251.41)明显升高(P<0.05);而IL-33+伊洛前列素组GATA3水平(MFI:10340.18±3293.21)较IL-33组明显降低(P<0.05);胞内染色检测分组培养72h后ILC2s核内Ki-67表达情况,结果显示:IL-33组Ki-67+ILC2s百分比(68.28±9.45%)较vehicle组(54.48±7.43%)、单独伊洛前列素组(50.36±5.83%)明显升高(P<0.05);而IL-33+伊洛前列素组Ki-67+ILC2s百分比(46.22±15.81%)较IL-33组明显降低(P<0.05)。三、分子实验结果1.ELISA结果ELISA检测72h时细胞培养上清,结果发现IL-33组细胞培养上清中IL-5及IL-13水平(IL-5:397.00±53.57 pg/m L,IL-13:284.85±36.92pg/m L)较vehicle组(IL-5:21.43±3.64 pg/m L,IL-13:20.25±2.19 pg/m L)、单独伊洛前列素组(IL-5:23.05±4.09 pg/m L,IL-13:20.70±4.46 pg/m L)有明显升高(P<0.05),而IL-33+伊洛前列素组细胞培养上清中IL-5及IL-13水平(IL-5:277.48±27.94,IL-13:19.90±3.44)较IL-33组明显降低(P<0.05)。2.Real-time PCR结果IL-33刺激组ILC2s中IL-5(1.69±0.46)、IL-13(1.90±0.56)、GATA3(0.78±0.36)相对表达量较vehicle组(1)和单独伊洛组(IL-5:0.39±0.20,IL-13:0.18±0.12,GATA3:0.24±0.09)明显上调(P<0.05);IL-33联合伊洛前列素组中IL-5(0.71±0.39)、IL-13(1.01±0.71)、GATA3(0.11±0.08)m RNA相对表达量明显下降(P<0.05);IL-33+伊洛前列素组(4.20±0.4)、单独伊洛前列素组(1.89±0.38)PPAR gamma相对表达量较IL-33刺激组(0.42±0.26)明显上升(P<0.05)。结论1.伊洛前列素可以改善IL-33诱导的肺部炎症状况;2.伊洛前列素可以抑制ILC2s的增殖;3.伊洛前列素可以抑制ILC2s分泌IL-5、IL-13的功能。