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第一部分建立GFP+骨髓的小鼠原位肝细胞肝癌模型目的：建立骨髓细胞稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠原位肝癌模型。方法：选择全身表达GFP的C57BL／6转基因雄性小鼠作为供体提供骨髓细胞,同种非转基因C57BL／6雄性小鼠为受体。采用钴60致死剂量全身照射方式毁髓后移植GFPC57BL／6供体小鼠骨髓,4周后肝内注射H22肝癌细胞建立小鼠原位肝癌模型。模型建立后第14天,采用流式细胞术分析骨髓重建后骨髓细胞的GFP阳性率,病理检测小鼠肝癌的病理特征。结果：流式检测结果显示原位肝癌模型小鼠外周循环有核细胞GFP阳性率在95%以上,提示骨髓细胞稳定表达GFP。病理观察发现小鼠肝癌出现肝内转移、瘤内出血与坏死,肿瘤组织内可见新生血.管。结论：成功建立骨髓稳定表达GFP的小鼠原位肝癌模型。第二部分内源性EPCs参与肝细胞性肝癌血管新生的实验研究目的：探讨骨髓来源内皮祖细胞是否参与肝细胞性肝癌新生血管的构建方法：建立骨髓细胞稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的小鼠原位肝癌模型。分别在建模后3,7,14,21天采集小鼠外周血,采用ELISA方法测定血清血管内皮生长因子,血小板衍化生长因子的血清浓度。采用流式细胞术方法定量分析循环EPCs数量的变化。通过荧光免疫以及定量PCR方法分析骨髓来源EPCs动员后在肝内组织中的分布情况。采用免疫荧光以及免疫组化方法观察骨髓源性EPCs是否参与肝细胞肝癌新生血管的构建。运用Westernblot,免疫组化方法分析粘附分子在肝癌组织与肝内无瘤组织中的表达水平。结果：随着肝癌的生长,血清血管内皮生长因子,血小板衍化生长因子浓度以及循环骨髓EPCs含量明显升高。通过GFP示踪直观地证明大量骨髓EPCs为肝癌组织动员、募集于肿瘤区域。肿瘤区域GFP平均光密度高于无瘤区5倍。肿瘤区域CD133,CD34mRNA相对表达水平分别是无瘤组织的5倍,3.8倍。Westernblot的结果显示肿瘤组织中粘附分子表达显著高于无瘤组织。骨髓来源的EPCs在肝癌组织中可以分化为血管内皮细胞而参与肝癌新生血管的构建,向且在肝癌新生血管中的比例随着肝癌进展而逐渐升高。结论：肝癌生长过程中,骨髓EPCs被动员募集至肝癌组织,并参与新生血管的构建而促进肿瘤的生长。随着肿瘤的发展骨髓EPCs在肿瘤新生血管中的参与率逐渐升高。肝癌组织局部高表达的粘附分子以及释放的细胞因子可能是影响EPCs迁移的重要分子机制。第三部分外源性EPCs参与肝细胞性肝癌血管新生的实验研究目的：观察外源性EPCs是否参与肝癌组织新生血管的构建方法：密度梯度离心法分离小鼠骨髓单核细胞,经EGM-2诱导培养后分别通过形态学观察、乙酰化低密度脂蛋(DiI-acLDL)和FITC-UEA-1双荧光染色法、成管实验以及流式细胞术检测体外培养EPCs的纯度。建立小鼠原位肝癌模型。在建模后第3天回输体外培养的P2代GFP+EPCs,建模后第7天分别摘取肝脏、心脏、肝脏、胰腺、脾脏。荧光显微镜下观察回输后GFP+EPCs在肝癌组织中的分布,以及在其它组织中的分布状况。同时采用荧光免疫方法观察回输EPCs是否参与肝癌组织新生血管的构建。结果：骨髓单核细胞经诱导培养后10天左右形成集落,2周后增殖加速并出现典型的铺路石样表现。培养的细胞可以摄取Dil-ac-LDL并且与FITC-UEA-1相结合。流式细胞术检测CD133+CD34+,以及CD133+VEGFR2+细胞分别在70%左右。在基质胶中培养后可以形成血管样结构。荧光显微镜下,在心脏、肺脏、胰腺、脾脏中几乎没有观察到回输的GFP+EPCs细胞。回输后的GFP+EPCs主要归巢到肝癌组织中,并分化为成熟的血管内皮细胞而参与肝脏组织新生血管的构建。结论：骨髓来源的单核细胞经体外诱导培养后可以稳定获得内皮祖细胞。通过回输体外培养的EPCs至肝癌小鼠,进一步证实骨髓源性EPCs可以被肝癌组织所募集并参与新生血管的构建。