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采用生长谱法确定了北京棒杆菌PD-67(Corynebaototium pekinense PD-67)的营养缺陷型为L-苯丙氨酸的完全缺陷型和L-酪氨酸的不完全缺陷型,并通过液体摇管法确定了最适于该菌株生长的L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的浓度。在此实验结果基础上,经摇瓶培养确定了C.pekinease PD-67的种子及发酵基本培养基。
以C.pekinense野生株AS1.299和突变株PD-67的基因组为模板,用PCR方法扩增了邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthetase EC4.1.3.27,AS)基因(trpEG)片段和前端控制序列。核酸序列分析结果表明,该片段全长3374bp,包含三个ORF,推测分别为前导肽基因trpL、AS component I基因trpE和AScomponent II基因trpG。C.pekinense野生株As1.299与突变株PD-67相比较,trpL基因完全一样;trpE基因有6个碱基的突变,导致了5个氨基酸残基的改变;trpG基因有一个碱基的突变,导致了1个氨基酸残基的改变;同时它们在-35序列处还有一个A→G的突变。通过同源性比较发现,C.pekinense AS1.299与Corynebacterium glutamicum ATCC13032和Brevibacterium lactofermentum的亲缘关系是很近的。trpL基因上游存在启动子区域,并能被Escherichia coli的RNA聚合酶所识别,实现异源互补。
对C.pekinense AS1.299和PD-67进行了L-色氨酸反馈抑制和反馈阻遏实验,实验结果表明C.pekinense PD-67的AS解除了反馈抑制和反馈阻遏控制。
野生型和突变型AS基因在C.pekinense AS1.299和PD-67中都得到表达,并且重组菌的酶活相对于宿主菌都有了很大提高。PD-67(pJW1)比PD-67的酶活提高了近55倍,PD-67(pJw3)比PD-67的酶活提高了近9倍,而AS1.299(pJW1)和AS1.299(pJW3)也有可检测出的酶活。
重组菌摇瓶发酵实验结果表明,带有突变型AS基因的PD-67重组菌生长比较慢,稳定期比PD-67推迟24个小时,但产生的L-色氨酸比PD-67高22.39%;带有野生型AS基因的PD-67重组菌在稳定期有最大的生物量,但产生的L-色氨酸比PD-67低32%。这说明AS酶活高低对L-色氨酸的产量有很大影响。