小脑为具有典型的皮质板层结构的脑区。小脑的板层形成始于生后并于生后第三周形成典型的三层结构,其中最外层为分子层,中间层为浦肯野细胞层,最内层为颗粒细胞层。在板层形成过程中,小脑的颗粒细胞在不同发育时期定位在不同的区域。小脑颗粒细胞的前体细胞在出生前主要集中在外颗粒层,随后通过放射状迁移由外而内不断向内颗粒层迁移,至生后第三周,外颗粒层消失,形成小脑皮层的三层结构。小脑颗粒细胞的放射状迁移是沿着贝克曼纤维完成的,这种贝克曼纤维是一种特殊的放射状纤维。贝克曼胶质是小脑皮质中一种单极星形胶质细胞。在小脑生后发育过程中,为适应颗粒神经元的迁移和分化贝克曼胶质细胞的形态需要经过一系列的变化:在小脑颗粒神经元内迁过程中贝克曼胶质纤维扮演了“脚手架”的角色介导颗粒神经元的放射状迁移,当颗粒神经元内迁过程完成以后,贝克曼胶质纤维回缩并逐步转化为成熟的星形胶质细胞。贝克曼胶质与大脑皮质放射状胶质细胞的形态转变与功能极为相似。由于小脑的皮质板层结构相对简单,因此更易于阐明板层发育模式的关键因素,并通过对贝克曼胶质细胞发育与分化的调控研究解析大脑皮质发育中放射状胶质细胞发育与分化的调控。核受体家族包括一系列转录因子,它们在结构上高度同源并由六个独立的功能结构域构成。近年研究发现核受体家族成员分子在小脑发育中亦有重要作用,如雌激素受体,睾丸受体等。肝X受体(1iver X receptor,LXR),包括LXRα和LXRβ两型,属于配体激活的转录因子家族。在胚胎11.5天时就检测到LXRα和LXRβ的表达,并在LXRs基因敲除小鼠中证实内源性LXRs可促进中脑的神经发生,参与多巴胺神经元的发育。此外,另一研究证实LXRβ在大脑皮层的表达与发育时程密切相关,在LXRβ基因敲除小鼠中观察到板层结构发育异常,其放射状迁移受到阻滞,并观察到放射状胶质细胞的形态异常。以上研究结果提示内源性LXRs参与中枢神经系统的发育,通过调节放射状胶质细胞的发育影响神经元的迁移及皮质的板层结构。已有研究表明LXRα和LXRβ在小脑中都有表达,并在成年LXRβ基因敲除小鼠中观察到旋杆行为检测异常,提示内源性LXRs的活化可能参与小脑的发育与功能,但是其作用机制与途径目前仍不明确。在本课题中首先检测LXRα和LXRβ在小脑皮质发育过程中的表达模式,明确内源性LXRs与小脑皮质发育的相关性。其次,LXRs激动剂T0901317可同时激活LXRα和LXRβ,本课题中在小鼠生后早期腹腔注射LXRs激动剂T0901317,并用BrdU标记新生的颗粒神经元来探讨激活内源性LXRs在小脑颗粒神经元迁移中的作用,并探讨对贝克曼纤维发育的影响及机制。最后,通过观察LXRs激动剂T0901317处理后对顺铂致小脑发育损伤后的作用,探讨LXRs对小脑皮质发育损伤的保护作用,进一步阐明LXRs对小脑发育的影响与机制。本研究包括三部分:第一部分分别从mRNA及蛋白水平检测LXRs在小脑发育中的时空表达模式采用矢状面相邻切片进行Nissl染色观察小鼠生后三周小脑各发育阶段的组织形态。通过检测LXRα和LXRβ在小脑生后三周各发育阶段的表达模式,明确LXRs与小脑皮质发育的相关性。主要结果如下:1.Nissl染色结果显示:生后三周为小脑发育的关键阶段其中包含了小脑皮质板层形成的关键细胞学事件,如:颗粒神经元的迁移、小脑叶片的形成及皮质三层结构的初步形成。2.运用RT-PCR检测LXRs的mRNA水平,结果发现:LXRα和LXRβ在生后三周均有表达,LXRα在小脑的各发育阶段表达都很低,在生后2天时LXRβ呈高表达,尤其在生后5天时,LXRβ表达至高峰,至生后8天、生后14天表达明显降低。提示小脑为以LXRβ表达为主的脑区,其表达模式与小脑皮质发育密切相关。3.运用免疫组化进行蛋白水平检测发现LXRα在小脑的各发育阶段表达都很低。LXRβ在外颗粒层低表达,但在浦肯野细胞层和内颗粒细胞层高表达。尤其在生后5天时,LXRβ表达至高峰,在内颗粒层表达最高。第二部分激活内源性LXRs在小脑皮层发育中对颗粒神经元迁移的影响及作用机制LXRs属于配体依赖的转录因子超家族,与相应的配体结合后才能被活化。氧化甾醇是LXRs的天然配体,包括22(R)、24(S)、27一羟基胆固醇等,非氧化甾醇类配体包括胆固醇生物合成的中间产物。化学合成的非甾醇类神经元激动剂有T0901317和GW3965等,它们能够激活两种LXRs受体,因而可以用来检测内源性LXRs的功能。本实验通过给新生小鼠注射LXRs激动剂T0901317来研究内源性LXRs在小脑发育阶段的功能,结合BrdU标记技术检测对小脑颗粒神经元迁移的影响并采用贝克曼胶质的标志物观察对贝克曼胶质的影响。近年来发现转化生长因子β1(Transforming growth factor beta1, TGF-β1)通过激活胞内信号通路Smad2/3与Smad4而促进离体培养的皮质放射状胶质细胞向星形胶质细胞转化,是目前证实的最重要的星形胶质化因子之一。本课题中通过检测TGF-β1与Smad4的水平,分析内源性LXRs对贝克曼胶质发育与分化的调控机制。主要结果如下:1.Nissl结果显示LXRs激动剂T0901317处理后对小脑的外形与组织结构无明显影响。Calbindin D-28K(浦肯野细胞标志物)免疫荧光显示:LXRs激动剂T0901317能够显著延长小鼠浦肯野细胞树突的长度,对浦肯野细胞数量却没有明显差别。2.Brdu标记技术显示LXRs激动剂T0901317可短暂的加速小脑颗粒神经元的迁移,PCNA免疫组化染色结果表明T0901317激活内源性LXRs对于颗粒神经元的增殖没有明显的作用。3.采用GFAP和BLBP免疫荧光染色来观察贝克曼纤维形态的变化,发现LXRs激动剂T0901317具有维持放射状胶质细胞表型并抑制向星形胶质细胞转化的重要作用。在mRNA水平检测到T0901317可下调小脑中TGF-β1 /Smad通路的表达,提示内源性LXR通过抑制小脑中TGF-β1 /Smad信号通路抑制贝克曼胶质向星形胶质细胞转化。第三部分肝X受体激动剂T0901317对顺铂致小脑皮质发育损伤的保护作用顺铂可诱导小脑颗粒神经元的凋亡并能影响生后大鼠小脑的形态。此外,在生后早期顺铂还可导致放射状胶质纤维卷曲、增厚等不规则的形态。本部分采用顺铂致小脑皮质发育障碍模型,运用LXRs激动剂预处理并结合形态与功能检测LXRs对小脑皮质发育损伤的保护作用。主要结果如下:1.Nissl染色结果显示:顺铂处理组小脑颗粒细胞和浦肯野细胞呈现出凋亡的特征,而经T0901317处理组凋亡特征明显得到改善。免疫荧光结果显示:顺铂处理组与对照组比,浦肯野细胞树突分枝明显减少变稀疏并且长度也变短,而T0901317处理组浦肯野细胞树突延长、分枝变茂盛但树突长度仍然比对照组短,分枝也较对照组少。2.GFAP免疫荧光结果显示:顺铂处理组贝克曼纤维卷曲、凌乱、排列紊乱,而T0901317处理组贝克曼纤维大部分呈放射状整齐排列,只有少数纤维仍卷曲。这表明LXRs激动剂T0901317对这种顺铂致小脑皮质发育的损伤具有保护作用。3.行为学检测结果显示:顺铂处理组小鼠在杆上的站立时间比对照组短,而经T0901317处理组小鼠的站立时间与顺铂处理组相比有所延长。综上所述,LXRs在小脑的时空表达模式与小脑皮层发育时程具有相关性,且小脑是以LXRβ表达为主的区域。激活内源性LXRs可通过调控TGF-β1信号通路影响贝克曼纤维与星形胶质细胞之间的转化进而影响小脑颗粒神经元的迁移,并可促进浦肯野细胞树突的延伸。LXRs激动剂T0901317对顺铂致小脑皮层发育损伤的保护作用进一步明确了LXRs在小脑皮质发育中的重要作用。