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目的本实验通过构建MMP-3真核表达质粒，探究pEGFP-N1与MMP-3能否成功构建真核重组质粒。通过原代培养的方法培养猪晶状体上皮细胞，进而将构建的真核重组质粒pEGFP-N1-MMP-3转染入培养好的晶状体上皮细胞中，通过westernblot检测表达产物，观察MMP-3在猪晶状体上皮细胞中是否表达。以期为研究该蛋白在晶状体上皮细胞的表达与功能奠定基础。方法1.委托生物公司合成人MMP-3。将含有pEGFP-N1的DH5α菌株和含有MMP-3的DH5α菌株接种于制备好的LB培养基中，37oC恒温摇床培养过夜。12-16h后将菌液按照试剂盒说明提取目的质粒。质粒MMP-3用限制性内切酶XHOⅠ和BglⅡ进行双酶切，载体pEGFP-N1用限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ进行双酶切，分别将酶切产物中的目的片段进行胶回收。连接目的片段pEGFP-N1与MMP-3，将重组质粒转化、扩增。分别采用双酶切与委托生物公司进行DNA测序两种方法鉴定重组质粒的正确性。2.市场新鲜宰杀的生猪眼球取出晶体，经抗生素PBS冲洗处理后，手术显微镜下撕取囊膜，以0.25%胰酶消化吸取上清，移入含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心，去上清，将重悬后的残液移入培养皿中，加全培养液37℃细胞培养箱培养。显微镜下动态观察细胞生长情况，在Nikon荧光显微镜下采集图片。将重组质粒转染入晶体上皮细胞，同时将不含有质粒的脂质体作为对照进行相同的转染步骤。48h后在Nikon荧光显微镜下采集图像。收获转染后的细胞，制备蛋白样品，用酶标仪检测fibronectin表达量，从而间接反映MMP-3表达情况。根据样本浓度计算电泳上样量，进行SDS-PAGE电泳后经western blot检测。用ImageJ1.44软件灰度分析western blot结果。结果1.真核表达载体的构建（1）真核细胞表达载体pEGFP-N1经过限制性内切酶EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后，其酶切结果的条带位于marker的4000-5000bp之间，与长度约为4713bp的pEGFP-N1基本吻合；合成质粒MMP-3经过限制性内切酶XHOⅠ和BglⅡ进行双酶切后，其酶切结果条带有两条，一个位于2500-3000bp之间，与长度约为2692bp合成质粒MMP-3的载体pMD18-T_simple_Vector基本相符，另一个条带位于1200-1500bp之间，与长度约为1434bp的目的片段MMP-3基本吻合。（2）重组质粒pEGFP-N1-MMP-3经1%琼脂糖凝胶电泳，可见质粒条带亮度较高，表示其浓度高，可以用于转染。经过EcoRⅠ和BglⅡ双酶切后，其酶切结果可见两个条带，一个位于4000-5000bp之间，另一个位于1200-1500bp之间，分别代表pEGFP-N1与MMP-3。（3）将生物公司的测序结果与GenBank中的人基质金属蛋白酶基因序列用JellyFish1.3软件分析比对,相似性达99.6%。2.原代细胞的培养与转染（1）培养至3-5天后在40倍镜下观察可见散在的细胞簇；10天左右100倍镜下观察可见细胞逐渐融合成片；约2周左右，细胞全部融合。（2）晶状体上皮细胞中MMP-3的表达：对照组细胞在普通光镜镜下可见，细胞镶嵌排列，无色，折光性强，荧光显微镜下未见GFP荧光；转染组细胞在普通光镜下可见细胞呈不规则多角形，无色，折光性强，荧光显微镜下可见成功转染上重组质粒的细胞发出绿色荧光。（3）以ImageJ1.44软件经灰度分析western blot结果可见，对照中的Fibronectin蛋白表达量明显高于转染重组质粒的细胞。（4）与对照组细胞FN的表达量相比，转染组细胞的FN表达量降低，差异有显著性（P＜0.05）。结论1.目的片段MMP-3可以以pEGFP-N1作为载体构建真核重组质粒。2．晶状体上皮细胞原代培养过程中，细胞生长较为活跃。将重组质粒转染入细胞后，细胞可以表达MMP-3蛋白。对照组与转染组中Fibronectin蛋白的表达量差异，对照组Fibronectin表达量高于转染组，而MMP-3的作用之一即为降解包括纤维粘连蛋白在内的胞外基质，进一步证实MMP-3蛋白表达的成功，及其生理作用的正常发挥。