论文部分内容阅读
目的：Ribozyme对RNA分子具有核酸内切酶活性，可以水解mRNA分子阻断基因表达，对疾病基因进行转录后抑制。PD-1是淋巴细胞表面的抑制性受体，通过与其配体结合传递抑制性信号，与免疫功能低下和肿瘤的免疫逃逸有关。本实验以PD-1基因为靶基因，采用慢病毒包装Ribozyme技术，通过降低PD-1基因的表达减弱或消除其抑制性信号，恢复T淋巴细胞的功能达到免疫调节的目的，对肿瘤免疫治疗有应用意义。方法：提取Jurkat细胞基因组，基因扩增、克隆得到包含内含子和外显子的PD-1基因；提取Jurkat细胞总RNA，逆转录获得PD-1基因的cDNA。体外转录获得PD-1基因的pre-mRNA和mRNA，采用随机寡核苷酸库结合逆转录（reverse transcription with random oligo library, RT-ROL）法筛选出pre-mRNA和mRNA反义寡核苷酸结合靶点，采用RNase H和DNAzyme体外验证其有效性，最终确定Ribozyme作用靶点，针对靶点设计、构建PD-1-Ribozyme的慢病毒载体质粒，包装慢病毒，感染Jurkat细胞，采用RT-PCR和Western Blot分析感染细胞PD-1基因的表达，将感染慢病毒后的Jurkat细胞与肝癌细胞HepG2共培养，ELISA检测培养上清中细胞因子IL-2、IL-10及IFN-γ的分泌及四唑盐比色法（MTS）检测感染后Jurkat细胞对HepG2的杀伤功能，评价下调基因表达的效果。结果：成功的构建了PD-1DNA和cDNA的阳性克隆；运用RT-ROL法筛选靶点、体外验证最终确定6个反义寡核苷酸结合靶点；对6个有效靶点设计构建了PD-1-Ribozyme质粒载体，包装出Ribozyme慢病毒并感染了Jurkat细胞；RT-PCR测得KD2、KD3、KD4、KD5四组mRNA水平表达下调，其中KD4下调效果达到80%，为mRNA水平最佳靶点，Western Blot结果显示KD2、KD3、KD4、KD5四组显著下调蛋白表达水平，其中KD4为效果最佳，达到80%；ELISA结果显示上清中IL-2的浓度KD3、KD4组分别为141.46±1.57pg/ml、190.33±2.89pg/ml，空白对照组为122.21±6.80pg/ml、阴性对照组为120.50±9.85pg/ml，两者显著高于对照组（p<0.01），KD2组的浓度为145.96±11.08pg/ml，明显高于空白对照组和阴性对照组（p<0.05）；上清中IL-10的浓度KD1、KD2、KD3、KD4组的浓度分别为34.79±1.60pg/ml、42.17±0.32pg/ml、42.62±0.62pg/ml和61.25±4.04pg/ml，均高于空白对照组（33.05±0.94pg/ml）、阴性对照组（33.44±1.69pg/ml），（p<0.01），KD5组的浓度为41.13±0.48pg/ml，明显高于空白对照和阴性对照组（p<0.05）；上清中IFN-γ的浓度KD2、KD4、KD5组分别为47.50±1.67pg/ml、68.17±2.03pg/ml和47.83±2.73pg/ml，空白对照组为35.94±1.17pg/ml、阴性对照组为34.72±1.95pg/ml，三个干预组均明显高于对照组（p<0.01），KD3组则为42.28±2.69pg/ml，显著高于空白和阴性对照组（p<0.05）。MTS实验结果显示，HepG2细胞的存活率KD2、KD3、KD4、KD5分别为57%、63%、52%、62%，与空白对照组（1）和阴性对照组（1）相比明显降低，p<0.05。结论：靶点筛选实验中，pre-mRNA和mRNA共筛选到6个靶点，其中6号靶点位于内含子上，其余5个位于外显子上；针对这6个靶点设计包装的Ribozyme慢病毒感染Jurkat细胞，RT-PCR与Western Blot结果基本一致，4号靶点为最佳靶点，其余效果较好的靶点依次为2、3、5号，内含子上的6号靶点效果较差；感染慢病毒的细胞与HepG2细胞共培养后，细胞因子的分泌2、3、4号靶点较空白对照组与阴性对照组明显上升，共培养体系中HepG2细胞的存活率2、3、4、5号靶点明显低于空白对照组与阴性对照组，细胞学实验证明针对PD-1基因靶点的Ribozyme具有下调基因表达的功能，并表明PD-1表达下调的Jurkat细胞能导致共培养的肝癌细胞HepG2出现增殖抑制。实验表明从靶点筛选设计的Ribozyme有效，为Ribozyme技术在下调基因表达和肿瘤免疫治疗的进一步应用提供了基础。