背景和目的:　　 葡萄糖激酶(GK)是葡萄糖代谢糖酵解途径的关键酶和限速酶。胰岛β细胞中的GK能感受机体葡萄糖水平的变化并调节胰岛素的分泌。GK基因突变可造成GK活性改变,引起血糖紊乱。GK杂合子突变导致青少年的成人发病型糖尿病2型(MODY2)。　　 MODY2是欧美高加索人最常见的MODY类型之一,非洲黑人中也有报道,但亚洲发病率极低,在日本仅占MODY不到1％的比例。我们前期在中国大陆人群中发现一个新的GK基因突变--E339K,这也是国内报道的首个引起MODY2的GK突变。为了明确E339K突变导致MODY2的分子机制,我们探讨了该突变的酶动力学特征和热稳定性,以及它们与临床表型之间可能存在的内在联系。　　 材料和方法:　　 1.MODY2家系资料的完善　　 GK基因E339K突变个体所在家系抽血查空腹血糖(FPG)、OGTT负荷后2h血糖(2hPG)、糖化血红蛋白(GHbAlc)、空腹胰岛素(FINS),计算相应HOMA-IR和HOMA-β；收集各成员的外周血DNA,并进行GK基因所有外显子PCR扩增、测序。　　 2.点突变的构建　　 通过酶切的方法将突变基因片段连接入带有谷胱甘肽S转移酶(GST)标签的野生型GK质粒pGEX3(GST-wGK-pGEX3)；转化感受态大肠杆菌(E.Coli)扩增质粒；提取质粒并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因并行测序和酶切鉴定。　　 3.野生型和突变型GK蛋白的表达、纯化　　 携带野生型或突变型GST-GK融合基因的质粒在E.Coli中表达GST-GK蛋白；单步亲和层析法纯化两种GST-GK融合蛋白。　　 4.酶动力学分析　　 采用NADP+与G6P偶联分析法。分别取0.1～200mM间的14个不同葡萄糖浓度或0.01～5mM间的9个不同ATP浓度,分光光度法连续测定反应的吸光度值。SigmaPlot10.0-Enzymec Kineties1.3酶动力学分析软件计算Vmax,S0.5,h,ATP-Km等。　　 5.热稳定性分析　　 将野生型或突变型GK分别在30～60℃问的7个不同温度下孵育30min,或在55℃下孵育0～30min的6个不同时间段,采用酶偶联分析法,观察不同温度或不同孵育时间对GK活性的影响。　　 6.统计学方法　　 每次实验均重复三次以上并得出一致的结果。计量资料以均数±标准差描述其特征,两组间比较采用t检验或非参数Mann-Whitney检验。SPSS11.5 forWindows统计软件处理数据。双侧p<0.05被设定为有统计学差异。　　 结果和讨论:　　 1.该MODY2家系中,基因测序证实先证者的母亲、哥哥、女儿和侄女存在GK基因E339K突变,并与高血糖共分离；突变共累及该家系3代5人。　　 2.先证者的女儿和侄女出生体重接近正常低限。母体孕期正常水平的血糖不足以触发携带GK突变胎儿的胰岛素释放,因此胎儿易于发生宫内发育迟缓和出生时低体重。　　 3.临床资料显示:与家系中非突变者相比,突变携带者FPG、2hPG、GHbAlc水平明显更高；FINS、HOMA-β明显更低；HOMA-IR无差异。这表明突变是GK的葡萄糖感受作用受损,并导致胰岛素分泌下降,但无明显胰岛素抵抗。　　 4.同在大肠杆菌(E.Coli)中表达并纯化,突变型GK的含量明显低于野生型GK。这表明E339K突变可能引起了GK蛋白表达下降或降解加速。　　 5.酶动力学分析显示:与野生型GK相比,突变型GK活力下降,表现为Vmax下降；与葡萄糖的亲和力下降,表现为S0.5升高；葡萄糖拐点(IP)浓度上升；与ATP的亲和力下降,表现为ATP-Km升高；葡萄糖同促协同作用,即希尔系数(h)无变化。酶动力学的改变最终导致催化活性和相对活性指数下降,这可能是E339K突变引起高血糖的机制之一。　　 6.热稳定性分析显示:与野生型GK相比,突变型GK在相对更低的温度下出现活性下降；相同温度孵育下,在相对更短的时间里出现活性下降。这表明热稳定性下降可能也是E339K突变引起高血糖的机制之一。　　 结论:　　 1.我们发现了一个亚洲人群极为罕见的典型的MODY2家系；　　 2.该家系中存在GK基因E339K突变,突变与高血糖共分离,是引起高血糖的遗传学背景；　　 3.GK蛋白表达下降或降解加速、酶动力学异常、催化活性下降及热稳定性下降可能是其导致高血糖的生化基础。　　 综上所述,我们发现并完善了中国大陆地区首个MODY2家系临床资料的收集和GK基因突变的功能学研究。该家系存在GK基因E339K突变,突变与高血糖共分离；临床资料表明突变携带者血糖明显升高,基础胰岛素分泌明显降低,但并未造成胰岛素抵抗；进一步的功能学研究发现酶动力学异常和热稳定性下降是E339K引起高血糖的可能机制。