研究背景:尖尾芋(Alocasia cucullata(Lour.)Schott)属于天南星科海芋属,广泛分布于我国云南、四川、广东、广西、贵州等省区。为《中国植物图谱数据库》收录的有毒植物之一,是传统壮药,有退热解毒、消肿镇痛功效;用于治疗多种肿瘤、流感、高热不退、钩端螺旋体病、毒蛇咬伤、毒蜂螫伤、慢性支气管炎等。目前对其药用价值关注甚少,多数药用功效只限于民间使用和记载,缺乏系统深入的药理研究,也影响了它的进一步开发和利用。本课题采用传统中药水煎方法,对这种水提物进行药效学研究,研究发现虽然尖尾芋对肿瘤细胞的直接抑制和杀伤作用相对较弱,但能通过增强脾细胞,腹腔巨噬细胞的活力,提高血清中IL-2、TNF-α、INF-γ等免疫因子来抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,还能延长黑色素瘤小鼠的生存期。说明尖尾芋提取物通过非特异性地激发和增强机体的免疫功能,使机体产生抗肿瘤免疫应答,从而控制和杀火肿瘤细胞。在体外,具有诱导单核细胞向巨噬细胞分化、释放TNF-α、IL-1β等抗肿瘤活性较强的细胞因子等作用,提示民间使用抗肿瘤作用可能是尖尾芋提升了患者的自身免疫作用。凝集素(lectin)是一类蛋白质或糖蛋白,具有糖结合专一性、可促使细胞凝集。凝集素在动、植物体内广泛存在,共作为一种重要的识别分子,在细胞内、细胞间或组织间发挥着重要的生理功能,可用于血型鉴定、细胞信号传导、恶性肿瘤细胞抑制、免疫应答和药物靶向定位的研究中。尽管植物凝集素早在1888年就被Hermann Stillmark发现,但凝集素的提取率低、纯化难、成本高,在一定程度上限制了凝集素的应用,所以各种提取分离方法的研究、比较、分析仍然是凝集素研究工作的重点之一。研究目的:传统对凝集素的提取方法一般是利用缓冲液4℃下浸泡药材过夜,提取时间长且效率低。本课题对尖尾芋凝集素提出以超声波处理药材来提取,探究此法与传统提取法相比对提取效率的影响,然后优化尖尾芋凝集素的提取工艺。层析是生物化学工作者在分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一,因此利用层析法对尖尾芋凝集素进行分离纯化,随后确定纯化效率以及该凝集素的相对分子质量。最后对尖尾芋凝集素的部分性质进行研究测定。本文对尖尾芋凝集素进行了提取、分离以及纯化,并对其部分基础性质进行初步研究,可为尖尾芋凝集素功能性开发提供理论基础。研究方法:1尖尾芋凝集素提取工艺的优化研究1.1提取方法的选择 将新鲜尖尾芋根茎削去外皮,洗净切碎,置于60℃烘箱烤干,粉碎成粗粉。取尖尾芋根茎粗粉10g共9份,均用50 mL的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.4)浸泡匀浆,放置1h后开始分别处理:①取7份分别用超声波(100 W)处理 0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min;②取2份在4℃下放置过夜(24 h)。处理液用数层纱布滤过,滤液经高速离心,取上清液,得到尖尾芋凝集素粗提取液1-1～1-7与2-1～2-2。取各组粗提取液,通过盐析沉淀、透析除盐后,加水定容,得到凝集素提取液1-1～1-7、2-1～2-2,贮存待用。检测上述各提取液的凝血活力、蛋白含量并计算出比活力。以比活力为指标判断以上两种提取方法的优劣,确定最佳提取方法。1.2提取缓冲液的选择 取尖尾芋根茎粗粉10 g共8份,分成4组,每组分别加入以下50 mL不同缓冲液浸泡1h,缓冲体系为:0.01 mol/L磷酸缓冲液(PB,pH 值 7.4);0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS,pH 值 7.4);0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(TB,pH 值 7.4);0.05 mol/L Tris-HCl 盐缓冲液(TBS,pH 值 7.4)。浸泡后以超声波处理,滤过,滤液经高速离心处理,取上清液,得到凝集素粗提取液,通过盐析沉淀,透析除盐后,加水定容,贮存备用。检测所得各提取液的凝血活力以及蛋白含量,计算出比活力。选择比活力高的提取液中所用的缓冲液作为本实验的提取缓冲液。1.3提取工艺的单因素实验 选取超声功率、超声时间、料液比、硫酸铵饱和度四个因素进行单因素试验。检测各提取液样品的血凝活力和蛋白质含量,以比活力作为指标,判断各提取因素对尖尾芋凝集素提取效果的影响。1.4提取工艺的优化 根据单因素实验的结果,选取对尖尾芋凝集素提取效果有影响的因素水平,以比活力为评价指标,用正交设计法进行实验(四因素三水平),工艺流程同提取纯化单因素试验工艺流程,得出血凝效果的最佳提取条件。2尖尾芋凝集素的分离纯化2.1尖尾芋凝集素粗品的提取 取尖尾芋根茎干品100g,粉碎成粗粉,用“1.4”所得的最优方案提取出尖尾芋凝集素提取液,真空冷冻干燥即得凝集素粗品。2.2 DEAE-52阴离子交换层析DEAE-52纤维素经活化后湿法装柱。取凝集素粗品10mg加蒸馏水定容至2mL,上样。用蒸馏水及递增浓度的NaCl溶液依次洗脱。通过紫外与凝集活性检测,收集具有凝血活性的蛋白峰,透析除盐,冻干,得到凝集素半纯品。2.3 Sephadex G-75分子筛层析 将Sephadex G-75活化后装柱。取凝集素半纯品20mg加蒸馏水定容至1mL,上样。用蒸馏水洗脱,通过紫外与凝集活性检测,收集具有凝血活性的蛋白峰,透析除盐,冻干,得到凝集素纯品。2.4尖尾芋凝集素凝血活力检测 对纯化后的凝集素进行凝血活力测定。2.5 SDS-PAGE凝胶电泳法纯度检测 分离胶浓度为11%,浓缩胶浓度为5.5%,点样量为40μg,60 V预电泳约30 min,待样品进入分离胶后,调电压至120 V,待溴酚蓝至凝胶底部边沿1 cm时停止电泳。小心剥离凝胶,用考马斯亮蓝R-250染色,再用脱色液使凝胶背景褪至无色,蛋白条带清晰可见为止。3尖尾芋凝集素的部分性质研究3.1热稳定性试验 把尖尾芋凝集素溶液分别置于于温度为30℃～100℃水浴中处理,然后测定各处理液的凝血活力。3.2酸碱稳定性试验 分别配置pH范围为2～13的缓冲液,测定各pH下尖尾芋凝集素溶液的凝血活力。3.3糖抑制试验 分别配制出一定含量的单糖或双糖溶液,测定各糖溶液环境下尖尾芋凝集素的凝血活力。3.4尖尾芋凝集素的紫外吸收图谱 在紫外光区测定尖尾芋凝集素溶液的吸光度,记录并绘制出紫外吸收图谱。研究结果:1.尖尾芋凝集素提取工艺的优化研究确定了提取方法为超声波处理,提取溶剂为0.01 moL/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH值7.4);通过单因素实验结果可知,提取过程中超声功率、超声时间、料液比、硫酸铵饱和度均对尖尾芋凝集素的提取效果有一定影响,并根据实验选出各因素适宜的范围进行正交试验。正交试验结果表明,尖尾芋凝集素的最佳提取工艺条件为:超声功率240 W,超声时间10 min,料液比1:8(g/mL),硫酸铵饱和度为90%,其中料液比对提取效果影响显著(P<0.05)。2尖尾芋凝集素的分离纯化尖尾芋凝集素粗品经DEAE-52柱层析纯化后,得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个洗脱峰,其中洗脱峰Ⅲ有凝集活性,收集峰Ⅲ洗脱液,冷冻干燥。再用Sephadex G-75柱层析进行进一步纯化,收集具有强凝集活性的峰1洗脱液,透析除盐,冷冻干燥,得到尖尾芋凝集素纯品。经检测,该凝集素的凝血活力为28。尖尾芋凝集素经SDS—PAGE电泳检测,显示单一条带,根据迁移率计算得出相对分子质量约为60 kDa。3尖尾芋凝集素的部分性质经热稳定实验结果显示,尖尾芋凝集素的耐热性差,当温度高于60℃时,该凝集素开始失活,90℃时,该凝集素完全丧失凝集活性。经酸碱稳定性实验结果显示,尖尾芋凝集素对酸、碱均敏感,仅在pH7～8环境下,凝集活性保持不变。糖抑制实验结果表明,N-乙酰葡萄糖胺能较强地抑制尖尾芋凝集素的凝集活性。紫外吸收光谱显示该凝集素的特征吸收峰为237 nm、276 nm。结论:1.经过对尖尾芋凝集素提取方法优化的研究,提出以超声波处理为提取方法,相对传统浸泡法而言,大大提高了提取效率。研究中通过单因素实验与正交试验,筛选出能将该凝集素提取效率有效提高的提取条件:超声功率240 W、超声时间10 min、料液比1:8(g/mL)、硫酸铵饱和度90%。2.尖尾芋凝集素粗品先后通过DEAE-52离子交换柱、Sephadex G-75凝胶柱后,能分离出具有强凝集活性的尖尾芋凝集素纯品。3.尖尾芋凝集素相对分子质量约为60kDa,凝血活力为28。该凝集素的耐热性差,应当贮存在60℃以下。其在pH7～8环境下,凝集活性保持不变。N-乙酰葡萄糖胺为尖尾芋凝集素的凝集活性抑制剂。紫外吸收光谱显示该凝集素的特征吸收峰为237 nm、276 nm。