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结直肠癌是最常见的人类恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势.随着手术、化疗及靶向药物联合治疗的综合应用,结直肠癌的生存率得到了一定程度的提高,但部分患者治疗效果仍然不尽人意.因此,寻找结直肠癌治疗特异性和灵敏性的靶点,提高结直肠癌的治疗效果是目前所面临的难题. 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族是一组跨膜糖蛋白,它具有酪氨酸激酶的活性,包括HER1 (ERBB1/EGFR)、HER2 (ERBB2)、HER3 (ERBB3)、HER4 (ERBB4)四个家族成员.HER4作为表皮生长因子受体家族的第4号成员,具有EGFR家族成员共同的结构特征.有研究提示,HER4与多种恶性肿瘤的发生发展及不良的预后密切相关. 目前关于HER4在结直肠癌中表达的意义及HER4的预测价值方面的研究十分有限,而且存在争议.因此需要更多的研究来明确HER4蛋白在结直肠癌中的表达情况及其与预后的关系.本研究通过应用免疫组化检测结直肠癌组织中HER4表达情况及其临床意义,构建能够靶向抑制HER4基因的慢病毒shRNA载体,并观察其基因沉默的效果,建立沉默HER4基因的结肠癌细胞株.观察HER4对结肠腺癌细胞增殖、凋亡、黏附及上皮间质转化的影响. 第一部分HER4在结直肠癌中表达的临床意义 目的:检测结直肠癌组织中HER4蛋白的表达情况,探讨HER4蛋白在结直肠癌中的临床意义. 方法: 1采用免疫组化的方法检测90例结直肠癌组织标本中HER4蛋白的表达情况. 2评价HER4蛋白的表达情况与临床病理特征之间的关系;采用统计方法分析HER4蛋白与结直肠癌患者生存期之间的关系. 结果: 1.临床病理特征 经过电话回访了解90例结直肠癌患者的生存情况,其中73例患者成功得到生存资料,随访率为81.1%.73例随访成功的患者包括结肠癌28例,直肠癌45例;男性36例,女性37例;≤60岁38例,>60岁35例;Ⅰ期+Ⅱ期41例,Ⅲ期32例;T1期2例,T2期14例,T3期22例,T4期35例;淋巴结转移阴性41例,淋巴结转移阳性32例.随访过程有19人死亡,死亡原因均为术后肿瘤的远处转移,其中肺转移11例,骨转移4例,多发转移5例,总生存率为73.97%. 2.HER4在正常结直肠组织及癌组织中的表达情况 HER4在正常结直肠组织中均为阴性表达,在结直肠癌组织中阳性表达的为25例,阳性表达率34.2%,阳性表达主要定位在细胞质和细胞膜中,表现为浅黄、棕黄及棕褐色不同强度的染色.HER4阴性表达的为48例,阴性表达率为65.8%. 3.HER4与结直肠癌各临床病理参数之间的关系 HER4的表达水平与结直肠癌患者的性别、年龄、肿瘤部位和分期均无显著相关性(P>0.05),与淋巴结转移有显著相关性(P<0.05).淋巴结阳性的患者阳性率高于淋巴结阴性的患者(60.0%VS 40.0%,P=0.039). 4.HER4与结直肠癌患者5年生存率的关系 HER4阳性的患者5年生存率为64.3%,HER4阴性的患者5年生存率为85.5%,两者比较有显著差异,HER4阳性患者的预后劣于HER4阴性的患者(P=0.020). 小结:结直肠癌组织中的HER4阳性表达与肿瘤的淋巴结转移相关，HER4阳性患者的预后劣于HER4阴性的患者. 第二部分 HER4基因沉默结肠癌细胞株的建立 目的:构建针对人HER4基因的短发夹结构RNA(shRNA)及其表达载体,转染人结肠癌细胞,建立HER4基因沉默的结肠癌细胞株. 方法: 1通过基因查序获得4条HER4基因的靶序列,连接到LV3慢病毒载体上,成功构建携带HER4基因的慢病毒shRNA载体. 2包装慢病毒,转染293T 细胞,获得高滴度的慢病毒浓缩液,对慢病毒浓缩液进行病毒滴度的测定. 3通过RT-PCR及Western Blot验证干扰效果,建立HER4基因沉默的结肠癌细胞株. 结果: 1.慢病毒载体的构建 HER4-shRNA1-4干扰载体经测序,结果与HER4-shRNA1-4寡居单链正链序列完全一致,证明4条HER4基因干扰载体构建成功. 2.慢病毒滴度测定 通过荧光显微镜结合稀释倍数计算病毒滴度,测得4组慢病毒滴度分别为: HER4-shRNA1的感染滴度约为3×108TU/mL HER4-shRNA2的感染滴度约为1×108TU/mL HER4-shRNA3的感染滴度约为1×108TU/mL HER4-shRNA4的感染滴度约为2×108TU/mL 3.慢病毒感染细胞情况 当慢病毒的感染滴度达到1×108TU/mL时,按照1:5稀释进行感染，shHER4-1、shHER4-2 、shHER4-3和shHER4-4四组病毒感染效率基本可达70%以上. 4.ShRNA慢病毒对HCT116细胞HER4 mRNA表达的影响 shHER4-1、shHER4-2 、shHER4-3和 shHER4-4组HER4 mRNA相对于H-ACTB的表达水平分别为 1.18±0.22、3.77±0.55、1.17±0.15、0.54±0.01,与阴性对照组(1.13±0.13)及空白对照组(1.0±0.13)相比shHER4-4的mRNA表达水平明显降低(P<0.05). 5.ShRNA慢病毒对HCT116细胞HER4蛋白表达影响 HCT116细胞、阴性对照细胞和shHER4-4组HER4蛋白表达水平灰度值分别为 2070±50、1446±48、769±37,shHER4-4组HER4蛋白表达水平灰度值有明显减弱(P<0.05). 小结:利用RNA干扰技术成功地建立了HER4基因沉默的结肠癌细胞株,为下一步实验提供了实验材料. 第三部分 HER4对结肠癌细胞增殖、凋亡、黏附及上皮间质转化的影响 目的:研究HER4对结肠癌细胞增殖、凋亡及及黏附的影响,探讨HER4在结肠癌细胞上皮间质转化中的作用,为临床通过调节结直肠癌HER4蛋白水平抑制肿瘤的侵袭转移提供理论基础. 方法: 1 应用MTT、流式细胞检测法和细胞基质黏附实验分别检测三组细胞的增殖、凋亡和黏附的情况. 2 应用 Western blot 检测三组细胞中 E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin蛋白的表达. 3 应用免疫荧光双染法检测三组细胞E-cadherin和Vimentin的表达. 结果: 1.沉默HER4基因对细胞增殖的影响 shRNA-HER4与空白对照及阴性对照组在24h、48h、72h相比较，OD值均明显减小,差异有统计学意义(shRNA-HER4组VS 空白对照组:P<0.05;shRNA-HER4组 VS 阴性对照组:P<0.05). 2.沉默HER4基因对细胞凋亡的影响 shRNA-HER4、空白对照及阴性对照组细胞凋亡率分别为（3.43 ±0.67)%、(0.76±0.33)%、(0.9±0.35)%.shRNA-HER4组与空白对照及阴性对照组相比较凋亡率差异有统计学意义(shRNA-HER4组VS 空白对照组:P<0.05;shRNA-HER4组 VS 阴性对照组:P<0.05). 3.沉默HER4基因对细胞基质黏附的影响. shRNA-HER4组细胞黏附的数量较空白对照和阴性对照组显著增加(P<0.05).shRNA-HER4组OD值在1h和2h较空白对照和阴性对照组显著增加,差异有统计学意义(shRNA-HER4组VS 空白对照组:P<0.05;shRNA-HER4组 VS 阴性对照组:P<0.05). 4.Western blot检测沉默HER4基因对细胞上皮间质转化的影响. shRNA-HER4组细胞中上皮标志物E-cadherin的表达较空白对照和阴性对照组显著上调(P<0.05),而间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达水平较空白对照和阴性对照组显著下调(P<0.05) 5.免疫荧光双染法检测E-cadherin和Vimentin的表达 shRNA-HER4、空白对照和阴性对照组三组细胞比较shRNA-HER4组细胞中上皮标志物E-cadherin 较空白对照和阴性对照组显著增多(P<0.05),而间质标志物Vimentin较空白对照和阴性对照组显著较少(P<0.05). 小结:HER4不仅促进细胞增殖抑制凋亡,还可以促进细胞发生上皮间质转化,进而减少结直肠肿瘤细胞黏附性促进肿瘤转移. 结论: 1.结直肠癌组织中的HER4阳性表达与肿瘤的淋巴结转移相关,HER4阳性患者的预后劣于HER4阴性的患者. 2. 利用RNA干扰技术成功地建立了HER4基因沉默的结肠癌细胞株,为下一步实验提供了实验材料. 3.HER4不仅促进细胞增殖抑制凋亡,还可以促进细胞发生上皮间质转化,进而减少结直肠肿瘤细胞黏附性促进肿瘤转移.