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肿瘤糖酵解及血管生成在实体癌的生长和转移中扮演重要角色，近年来受到越来越多的关注。然而，目前，还没有针对肿瘤细胞代谢的明显有效药物。结直肠癌（CRC）是全世界癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率在中国近十年来一直呈上升趋势。目前手术切除和术后辅助治疗，特别是分子靶向治疗的应用是结直肠癌相对有效的治疗方法。但是，结直肠癌患者术后复发和转移的发生率较高，且结直肠癌的总体预后仍然很差。因此，迫切需要新的分子诊断和治疗靶标。结直肠癌的发生发展是一个多步骤的过程，涉及多种因素，包括各种非编码RNA（Non-codingRNA）中的微小RNA（miRNA）的表达水平改变。越来越多的证据表明miRNA的异常表达涉及多种肿瘤发生、增殖、转移和侵袭。然而，miRNA调节结直肠癌代谢的研究还处于初步探索阶段。因此，对影响肿瘤代谢的miRNA的功能和机制的研究将为结直肠癌的诊断和治疗开辟一条新的途径。
研究目的：
本研究旨在探讨非编码RNA miR-103a-3p在结直肠癌细胞糖酵解途径中的分子生物学作用及其机制。首先，通过基因表达数据库筛选出与结直肠癌相关差异表达的miR-103a-3p，并检测miR-103a-3p在结直肠癌组织中的表达和临床意义。其次，体外研究了miR-103a-3p的表达对结直肠癌细胞糖酵解及其相关生物学功能的影响。随后，进一步研究了miR-103a-3p是否通过Hippo/YAP1通路调节HIF1A表达而实现对结直肠癌发生发展的影响，预测并验证miR-103a-3p靶向Hippo/YAP1通路的核心分子LATS2和SAV1的作用关系。最后，证实miR-103a-3p可能是通过调控Hippo/YAP1通路促进HIF1A表达而进一步影响结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移和糖酵解的发生发展过程。我们的研究揭示了miR-103a-3p/YAP1/HIF1A轴在结直肠癌细胞糖酵解中的作用及分子生物学功能机制，这将为结直肠癌早期诊断和后续分子靶向治疗提供潜在的新靶点和途径。
第一部分：MiR-103a-3p在结直肠癌组织中的表达和临床意义
研究方法：
1．在基因表达数据库（GEO）下载结直肠癌miRNA芯片数据，并分析miR-103a-3p在结直肠癌组织和配对癌旁正常组织的表达差异。
2．收集标本，包括40例结直肠癌患者的癌和癌旁正常组织标本，应用qRT-PCR方法检测癌及癌旁正常组织中miR-103a-3p的表达情况。
3．应用qRT-PCR方法检测人正常结直肠黏膜细胞株NCM460，人结直肠癌细胞株SW480、HT-29、CaCo2、SW620及HCT116中miR-103a-3p的表达情况。
4．依据miR-103a-3p的表达情况，运用单因素变量分析其与结直肠癌病人性别、年龄、肿瘤大小、临床分期及有无远处转移、淋巴结转移和脉管浸润之间的相关性，并运用Kaplan-Meier方法对其进行生存分析。
研究结果：
1.检索GEO数据库，在基因芯片数据集GSE49246和GSE115513中，分析得知miR-103a-3p在结直肠癌组织中的表达显著上调（p<0.001）。
2.在40例结直肠癌患者的癌组织中miR-103a-3p的表达显著高于癌旁正常组织（p=0.008）。
3.在人结直肠癌细胞株中，miR-103a-3p的表达水平在HCT116中最高，在SW480中最低，且均高于其在正常结直肠黏膜细胞株NCM460中的表达水平。
4.MiR-103a-3p的表达程度与结直肠癌患者远处转移相关，且miR-103a-3p高表达的患者生存期短。
第二部分：体外调控miR-103a-3p表达对结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解的影响
研究方法：
1.构建miR-103a-3p过表达（miR-103a-3p）和沉默表达（sh-miR-103a-3p）及相对应的对照组的质粒，分别稳定转染到SW480和HCT116细胞中，低氧环境培养。应用Transwell细胞侵袭及迁移实验检测稳转sh-miR-103a-3p的HCT116细胞的侵袭及迁移能力。
2.应用CCK-8实验检测稳转sh-miR-103a-3p的HCT116细胞的增殖能力。
3.应用血管生成实验分别检测稳定敲除miR-103a-3p的HCT116细胞和稳定过表达miR-103a-3p的SW480细胞的血管生成能力，与稳定转染相应空载体的细胞相比。
4.分别检测稳定过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞的细胞培养基酸度（即PH值）。
5.应用qRT-PCR实验检测过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞中HIF1A和其下游糖酵解基因HK2、LDHA、PFK1和PKM的转录水平。
研究结果：
1.与对照组相比，miR-103a-3p的敲除显著抑制了HCT116细胞的侵袭和迁移能力。
2.与对照组相比，敲除miR-103a-3p的HCT116细胞的生长在转染3天后出现显著抑制（p＜0.05），并随着时间延长而逐渐下降。
3.与稳定转染相应空载体的细胞相比，miR-103a-3p的稳定过表达或敲除分别促进和减少了SW480和HCT116细胞的血管生成。
4.在稳定过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞中，细胞营养液的酸性(即PH值)分别显著上调和下调。
5.稳定敲除的miR-103a-3p降低了HCT116细胞中HIF1A及HK2、LDHA和PFK1的转录水平；稳定过表达的miR-103a-3p增加了SW480细胞中HIF1A及其下游糖酵解基因HK2、LDHA和PKM的转录水平。
第三部分：MiR-103a-3p靶向LATS2和SAV1调控Hippo/YAP1轴促进HIF1A表达影响结直肠细胞癌糖酵解和生物学功能的机制研究
研究方法：
1.应用生物信息学网站（Targetscan，miRDB，Tarbase和TIPA）预测miR-103a-3p可能靶向的基因，Venn图进行进一步筛选。应用生物信息学网站（TargetScan）预测LATS2和SAV1mRNA的3UTR与miR-103a-3p的互补结合位点。
2.双荧光素酶报道基因实验验证miR-103a-3p直接与LATS2和SAV1mRNA的3UTR的预测结合位点结合。
3.应用qRT-PCR实验检测过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞中Hippo途径的核心分子MST1,SAV1,LATS1,LATS2,MOB1,YAP1,TAZ和TEAD1的转录水平。
4.构建YAP1过表达（YAP1）和敲除（si-YAP1）的HCT116细胞株，通过qRT-PCR和免疫印迹试验明确逆转YAP1对HIF1A表达调控的影响。
5.构建HIF1A过表达（HIF1A）和敲除（si-HIF1A）的HCT116细胞株，应用EdU增殖实验检测敲除YAP1或敲除HIF1A的HCT116细胞的增殖能力；用YAP1，si-YAP1，HIF1A和si-HIF1A设计侵袭转移的补救实验，验证YAP1通过HIF1A调节结直肠癌细胞的生物学功能。
6.设计补救实验，检测细胞培养基酸度（即PH值）明确逆转YAP1，HIF1A对miR-103a-3p调节糖酵解的影响。
研究结果：
1.通过生物信息学分析得出miR-103a-3p可能靶向LATS2和SAV1。
2.双荧光素酶报道基因实验证实了miR-103a-3p直接靶向结合LATS2和SAV1。
3.结果表明，与稳定转染空白质粒的细胞相比，稳定敲除miR-103a-3p可以增加了HCT116细胞中LATS2和SAV1的转录水平，并降低YAP1的转录水平；稳定过表达miR-103a-3p降低了LATS2和SAV1的转录水平，并增加了YAP1的转录水平。
4.qRT-PCR和免疫印迹试验分析表明，在稳定过表达或敲除YAP1的HCT116细胞中，HIF1A的转录及蛋白水平与YAP1的表达量呈相似的变化趋势。
5.结果表明，敲除YAP1或HIF1A后减弱了HCT116细胞的增殖活性；YAP1或HIF1A敲除减弱了HCT116细胞的迁移，而HIF1A过表达部分逆转了YAP1敲除的作用，YAP1过表达部分逆转了HIF1A敲除的作用。
6.结果表明，miR-103a-3p的过表达或敲除细胞模型分别上调和下调SW480和HCT116细胞中细胞营养液的酸性。YAP1或HIF1A敲除部分恢复了miR-103a-3p过表达的作用，而YAP1或HIF1A的过量表达部分恢复了miR-103a-3p敲除的作用。
研究结论：
1.MiR-103a-3p在结直肠癌组织和细胞系中均高表达，并与患者的生存时间呈负相关，提示与预后不良有关。
2.体外实验表明过表达的miR-103a-3p可以促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解。
3.MiR-103a-3p可以靶向Hippo/YAP1通路的核心分子LATS2和SAV1来促进HIF1A表达，从而促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解。
研究目的：
本研究旨在探讨非编码RNA miR-103a-3p在结直肠癌细胞糖酵解途径中的分子生物学作用及其机制。首先，通过基因表达数据库筛选出与结直肠癌相关差异表达的miR-103a-3p，并检测miR-103a-3p在结直肠癌组织中的表达和临床意义。其次，体外研究了miR-103a-3p的表达对结直肠癌细胞糖酵解及其相关生物学功能的影响。随后，进一步研究了miR-103a-3p是否通过Hippo/YAP1通路调节HIF1A表达而实现对结直肠癌发生发展的影响，预测并验证miR-103a-3p靶向Hippo/YAP1通路的核心分子LATS2和SAV1的作用关系。最后，证实miR-103a-3p可能是通过调控Hippo/YAP1通路促进HIF1A表达而进一步影响结直肠癌细胞增殖、侵袭、转移和糖酵解的发生发展过程。我们的研究揭示了miR-103a-3p/YAP1/HIF1A轴在结直肠癌细胞糖酵解中的作用及分子生物学功能机制，这将为结直肠癌早期诊断和后续分子靶向治疗提供潜在的新靶点和途径。
第一部分：MiR-103a-3p在结直肠癌组织中的表达和临床意义
研究方法：
1．在基因表达数据库（GEO）下载结直肠癌miRNA芯片数据，并分析miR-103a-3p在结直肠癌组织和配对癌旁正常组织的表达差异。
2．收集标本，包括40例结直肠癌患者的癌和癌旁正常组织标本，应用qRT-PCR方法检测癌及癌旁正常组织中miR-103a-3p的表达情况。
3．应用qRT-PCR方法检测人正常结直肠黏膜细胞株NCM460，人结直肠癌细胞株SW480、HT-29、CaCo2、SW620及HCT116中miR-103a-3p的表达情况。
4．依据miR-103a-3p的表达情况，运用单因素变量分析其与结直肠癌病人性别、年龄、肿瘤大小、临床分期及有无远处转移、淋巴结转移和脉管浸润之间的相关性，并运用Kaplan-Meier方法对其进行生存分析。
研究结果：
1.检索GEO数据库，在基因芯片数据集GSE49246和GSE115513中，分析得知miR-103a-3p在结直肠癌组织中的表达显著上调（p<0.001）。
2.在40例结直肠癌患者的癌组织中miR-103a-3p的表达显著高于癌旁正常组织（p=0.008）。
3.在人结直肠癌细胞株中，miR-103a-3p的表达水平在HCT116中最高，在SW480中最低，且均高于其在正常结直肠黏膜细胞株NCM460中的表达水平。
4.MiR-103a-3p的表达程度与结直肠癌患者远处转移相关，且miR-103a-3p高表达的患者生存期短。
第二部分：体外调控miR-103a-3p表达对结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解的影响
研究方法：
1.构建miR-103a-3p过表达（miR-103a-3p）和沉默表达（sh-miR-103a-3p）及相对应的对照组的质粒，分别稳定转染到SW480和HCT116细胞中，低氧环境培养。应用Transwell细胞侵袭及迁移实验检测稳转sh-miR-103a-3p的HCT116细胞的侵袭及迁移能力。
2.应用CCK-8实验检测稳转sh-miR-103a-3p的HCT116细胞的增殖能力。
3.应用血管生成实验分别检测稳定敲除miR-103a-3p的HCT116细胞和稳定过表达miR-103a-3p的SW480细胞的血管生成能力，与稳定转染相应空载体的细胞相比。
4.分别检测稳定过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞的细胞培养基酸度（即PH值）。
5.应用qRT-PCR实验检测过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞中HIF1A和其下游糖酵解基因HK2、LDHA、PFK1和PKM的转录水平。
研究结果：
1.与对照组相比，miR-103a-3p的敲除显著抑制了HCT116细胞的侵袭和迁移能力。
2.与对照组相比，敲除miR-103a-3p的HCT116细胞的生长在转染3天后出现显著抑制（p＜0.05），并随着时间延长而逐渐下降。
3.与稳定转染相应空载体的细胞相比，miR-103a-3p的稳定过表达或敲除分别促进和减少了SW480和HCT116细胞的血管生成。
4.在稳定过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞中，细胞营养液的酸性(即PH值)分别显著上调和下调。
5.稳定敲除的miR-103a-3p降低了HCT116细胞中HIF1A及HK2、LDHA和PFK1的转录水平；稳定过表达的miR-103a-3p增加了SW480细胞中HIF1A及其下游糖酵解基因HK2、LDHA和PKM的转录水平。
第三部分：MiR-103a-3p靶向LATS2和SAV1调控Hippo/YAP1轴促进HIF1A表达影响结直肠细胞癌糖酵解和生物学功能的机制研究
研究方法：
1.应用生物信息学网站（Targetscan，miRDB，Tarbase和TIPA）预测miR-103a-3p可能靶向的基因，Venn图进行进一步筛选。应用生物信息学网站（TargetScan）预测LATS2和SAV1mRNA的3UTR与miR-103a-3p的互补结合位点。
2.双荧光素酶报道基因实验验证miR-103a-3p直接与LATS2和SAV1mRNA的3UTR的预测结合位点结合。
3.应用qRT-PCR实验检测过表达或敲除miR-103a-3p的SW480和HCT116细胞中Hippo途径的核心分子MST1,SAV1,LATS1,LATS2,MOB1,YAP1,TAZ和TEAD1的转录水平。
4.构建YAP1过表达（YAP1）和敲除（si-YAP1）的HCT116细胞株，通过qRT-PCR和免疫印迹试验明确逆转YAP1对HIF1A表达调控的影响。
5.构建HIF1A过表达（HIF1A）和敲除（si-HIF1A）的HCT116细胞株，应用EdU增殖实验检测敲除YAP1或敲除HIF1A的HCT116细胞的增殖能力；用YAP1，si-YAP1，HIF1A和si-HIF1A设计侵袭转移的补救实验，验证YAP1通过HIF1A调节结直肠癌细胞的生物学功能。
6.设计补救实验，检测细胞培养基酸度（即PH值）明确逆转YAP1，HIF1A对miR-103a-3p调节糖酵解的影响。
研究结果：
1.通过生物信息学分析得出miR-103a-3p可能靶向LATS2和SAV1。
2.双荧光素酶报道基因实验证实了miR-103a-3p直接靶向结合LATS2和SAV1。
3.结果表明，与稳定转染空白质粒的细胞相比，稳定敲除miR-103a-3p可以增加了HCT116细胞中LATS2和SAV1的转录水平，并降低YAP1的转录水平；稳定过表达miR-103a-3p降低了LATS2和SAV1的转录水平，并增加了YAP1的转录水平。
4.qRT-PCR和免疫印迹试验分析表明，在稳定过表达或敲除YAP1的HCT116细胞中，HIF1A的转录及蛋白水平与YAP1的表达量呈相似的变化趋势。
5.结果表明，敲除YAP1或HIF1A后减弱了HCT116细胞的增殖活性；YAP1或HIF1A敲除减弱了HCT116细胞的迁移，而HIF1A过表达部分逆转了YAP1敲除的作用，YAP1过表达部分逆转了HIF1A敲除的作用。
6.结果表明，miR-103a-3p的过表达或敲除细胞模型分别上调和下调SW480和HCT116细胞中细胞营养液的酸性。YAP1或HIF1A敲除部分恢复了miR-103a-3p过表达的作用，而YAP1或HIF1A的过量表达部分恢复了miR-103a-3p敲除的作用。
研究结论：
1.MiR-103a-3p在结直肠癌组织和细胞系中均高表达，并与患者的生存时间呈负相关，提示与预后不良有关。
2.体外实验表明过表达的miR-103a-3p可以促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解。
3.MiR-103a-3p可以靶向Hippo/YAP1通路的核心分子LATS2和SAV1来促进HIF1A表达，从而促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移、血管生成和糖酵解。