论文部分内容阅读
研究背景银屑病作为一种困扰广大患者的慢性遗传性皮肤病,长期以来给患者的生理和心理带来了巨大伤害。银屑病以表皮角质形成细胞过度增殖、炎性毛细血管增生,炎症细胞弥漫浸润为病理学特点,目前引起银屑病的发病机制还未能明确。寻常型银屑病(Psoriasis vulgaris,PV)是其中发病率最多的一型,其临床致死率比脓疱型银屑病、红皮型银屑病、关节型银屑病稍低,但是皮肤损害更为广泛。寻常型银屑病的主要临床表现为皮肤的红斑鳞屑性改变,其产生的剧烈瘙痒感及不美观的外观表现使患者深受困扰。57.3%的寻常型银屑病被确诊为中重度,患者皮肤的大面积肥厚性红斑和严重脱屑易引起恐惧感,许多患者由此被孤立而产生自卑心理,甚至影响其择偶婚配、就业谋生等正常生活,34%的患者出现抑郁自杀倾向[1],对患者的生活质量造成巨大影响。银屑病患者的组织病理表现具有特异性,包括表皮细胞增生显著、真皮炎症向下蔓延、新生毛细血管弥散增生。其发病机制极为复杂,目前已了解的病因主要涵盖遗传与环境、免疫与感染等各方各面[1]。目前普遍认为角质形成细胞(Keratinocytes,KC)在免疫介导作用下的过度增殖是引起银屑病的重要发病特征之一。转录因子Spl(specificity protein 1,Spl)可特异性识别DNA中GC序列富集的区域并与之结合,其结构性表达于人体的皮肤、乳腺、子宫、胃肠道等部位。由于Sp1可以和GC序列富集的位点相结合,许多管家基因及人体组织特异性基因都具有此结构,所以皆受其影响,从而参与细胞发育及代谢等生理过程。本研究通过研究Sp1在寻常型银屑病皮损中的差异性表达,进而探究Sp1与银屑病严重程度的关系,进一步研究Sp1对银屑病角质形成细胞增殖的影响。为Sp1影响银屑病发生发展的分子发病机制提供前期研究基础。研究目的本研究通过采用免疫组化染色法、实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)、western blot蛋白印迹法等遗传学实验方法,在银屑病和正常对照者的皮肤组织、在细胞层面比较转录因子Sp1的差异性表达。通过基因干扰技术进一步验证Sp1对角质形成细胞的增殖功能的调控,初步探讨转录因子Sp1与角质形成细胞的相关性。研究方法本课题组于2018年8月~2019年5月在广东省皮肤病医院收取皮肤科门诊51例银屑病患者和54例美容科健康受试者,分别留取其银屑病皮损标本及健康皮肤组织,按照性别及年龄对应的条件进行分子实验,通过免疫组织化学染色法(Immunohistochemistry,IHC)、实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、蛋白质印迹法(western blot)等分子遗传学检测,检测皮组织中Sp1在致病组与对照组m RNA水平及蛋白质水平的表达情况;采用基因敲降技术(Gene knock-down)对Hacat细胞中的Sp1基因进行处理使其表达沉默,随后检测细胞的生长发育等功能,验证Sp1对KC功能的影响。研究结果免疫组化染色显示转录因子Sp1在银屑病组较正常对照组表达高,银屑病组广泛表达于表皮各层细胞核,以棘层和基底层为主。通过计算平均光密度值对两组进行统计学分析,结果具有统计学意义。(n=24,p=0.0127)分子生物学研究显示皮组织中银屑病组相较于健康对照组,Sp1在m RNA水平及蛋白水平表达均呈现高表达状态,差异具有统计学意义。差异具有统计学意义(RT-q PCR:n=25,p=0.0057)(Western blot:n=56,p<0.0001)。Pearson相关系数分析得出PASI评分与Sp1在m RNA水平的表达量之间呈线性正相关,相关程度较大。(R=0.9173,p<0.0001)故寻常型银屑病严重程度与Sp1的表达量呈正相关。在细胞层面的研究上,对Sp1基因敲降处理后的Hacat细胞行cck-8计数法和绝对细胞计数法,敲低组细胞生长缓慢,细胞数量减少,提示Sp1可促进角质形成细胞增殖。研究结论转录因子Sp1与寻常型银屑病的发病存在相关性;寻常型银屑病患者皮损中Sp1表达水平的增高可以通过促进角质形成细胞的增殖,为进一步研究Sp1参与银屑病的发生发展过程提供前期研究工作。