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酶法制备具有生物活性的蛋白水解物及其在食品工业中的应用正受到越来越多的重视。具有特定功能的蛋白水解物可以用作功能性食品配料或添加到运动型饮料中，还可以作为临床营养食品适用于对大分子蛋白质有代谢缺陷的人群。
将超滤/纳滤膜技术和水解反应器结合起来，可以实现水解物从酶解产物中的连续分离。对于乳蛋白(酪蛋白和乳清蛋白)及其它种类蛋白的酶水解而言，酶膜反应(EMR)是一条新兴的工艺路线。与分批式水解相比，酶膜反应中酶可以反复利用，抑制酶反应的水解产物能够及时分离。
本研究利用酶膜反应器水解乳清分离蛋白，考察了各种因素对酶膜反应的影响，并采用可靠的统计分析方法旨在揭示因素间的复杂关系，同时还对影响膜通量动力学的酶水解条件进行了研究和优化，最后对水解产物的免疫活性、抗氧化活性及等电点溶解性进行了研究。
首先在1 L批式反应器中对水解乳清分离蛋白(WPI)的酶进行了筛选。分别以2％(v/v)的WPI乳清分离蛋白和2％(v/v)的酪蛋白为底物，测定并比较了Alcalase 2.4L.(EC 3.4.21.62)、Flavourzyme(EC 3.4.11.1)、Protease A(EC 3,4.24,39)及Protease N(IUB 3.4,24.28)4种酶的酶活，并测定了反应结束后的残余酶活、水解产物的相对分子质量分布以及游离氨基酸含量。结果表明：Protease N和Alcalase 2.4L分别对WPI和酪蛋白的水解活性最高。水解WPI时，Alcalase 2.4L、Protease N和Protease A都能产生短肽，但Alcalase 2.4L不易被底物抑制，ProteaseN易被水解产物抑制，而Protease A则释放出大量的游离氨基酸。Flavourzyme对WPI的水解能力最弱，水解释放的游离氨基酸也最多。在用反相高压液相色谱(RP-HPLC)分析游离氨基酸之前，采用5％三氯乙酸(TCA)和3.5％磺基水杨酸(SSA)能沉淀除去Flavourzyme和Protease A水解产物中的短肽，而对Alcalase 2.4L和Protease N酶解产物中短肽的去除效果并不明显。
水解WPI的各种酶按活性排列依次为Flavourzyme)，酶的渗漏(A<,leakage>)及酶的损失(A<,loss>)之间的一种平衡，对实验结果的分析仅需1h。
采用响应面(RSM)中心点旋转设计方法考察和优化了酶膜反应器中水解WPI的操作参数，并通过主成分分析法(PCA)对实验结果进行了多元数据分析。WPI的酶解条件为：在10 kDa或3 kDa的切向流(TFF)酶膜反应器中，采用Protease N对初始浓度为5％(w/v)的WPI在55℃，pH 7.0条件下连续水解5h。响应面实验选取的三个因素及其水平分别为：进料温度(A:25-55℃)，初始膜透水量Ji(B:1.6-18.4 mL/min)和加酶量(C:0.5-5.5g)。响应变量分别为：残余酶活，酶的渗漏，酶的损失，平均膜通量以及透过液中的蛋白质回收率。由于酶解时采用的ProteaseN最适作用温度为55℃，因此当进料温度低于55℃时，在膜的入口和出口处分别加装了能冷却和再加热的温控装置。实验结果表明：进料温度低至25.30℃时，J<,average>大幅下降，50℃时高活性的酶能水解溶化膜表面的动态凝胶层，使得J<,average>得到稳定，同时S<,apparenl>和A<,leakage>增加，而A<,residual>下降J<,average>和S<,apparent>随着进料温度、J<,i>和酶浓度的增加而升高。Protease N酶活损失的主要原因有：低膜通量时的产物抑制作用，低酶浓度时的底物抑制作用，以及高膜通量和高进料温度时酶的渗漏加剧。酶膜反应时高的循环速率还能防止底物沉积于膜上，从而有助于维持较高的J<,average>。
由响应面分析并优化后得到的最佳工艺条件是：WPI浓度，约5％；J<,i>，约15 mL/min；进料温度，50℃：加酶量：约3.0 g/1000 mL。在此优化条件下进行验证实验，结果与模型预测值十分吻合。在最佳条件下，单独使用10 kDa或3kDa的一步酶膜反应，蛋白质回收率分别为68.48％和45.24％，J<,average>分别为79.41％和40.00％，而A<,residual>分别为34.63％和48.44％。将经过10 kDa反应的水解液再通过3 kDa的两步酶膜反应中，第二阶段(3 kDa)回收的蛋白质占第一阶段(10 kDa)回收蛋白质的52.86％，占原料总蛋白质的21.62％。第二阶段的J<,average>和A<,residual>分别为78.26％和54.50％。单独使用10 kDa和3 kDa的一步反应的Aresldual分别为48.44％．34.63％。主成分分析显示：PCI和PC3(透过液和底物的动力学特性)累计方差贡献率约达到酶膜反应原始信息的60％，其中进料温度、S<,apparent>、A<,leakage>和J<,average>四个因素对这两个主成分有显著的影响：PC2(反映酶在反应器中的残留率)的方差贡献率为27.78％。因此，当进料温度合适时，膜表面上底物的溶解性好且体系的粘度低，再加上高活性的酶可以水解膜表面的凝胶层，从而有利于获得稳定的膜通量及较高的产物得率。
目前，用酶膜反应水解蛋白质时缺少一种标准的方法来计算水解度(DH)。所以本研究设计了一种新方法，在使用10 kDa或3 kDa的膜进行水解乳清蛋白时用其测定产物水解度。使用Protease N在pH 7.0，55℃的条件下连续水解WPI，产生的水解物及时通过膜得到分离。透过液DH(DH<,permeate>)和回流液DH(DH<,retentate>)可通过使用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)测定游离α-NH<,2>的浓度来计算。总酶膜反应DH(DH<,EMR>)可以通过DH<,permeate>和DH<,retentate>经计算得出。DH<,EMR>代表酶膜反应水解过程中的真实DH，和使用pH-stat方法得到的DH相比，发现后者值偏高，而通过水解产物的相对分子质量和游离氨基酸分析也证明了由pH-stat得出的DH并不合理。DH<,EMR>仍保留了在分批式水解过程中广泛应用的DH的内涵，即提供了一个有用的参数能够直观地将水解物与它们的功能性质和/或生物活性联系起来。用TNBS方法评价酶膜反应中的DH更可靠。采用10 kDa的TFF进行一步反应，DH<,permeate>，DH<,retentate>和DH<,EMR>分别为36.05％，12.81％和27.12％。采用3 kDa的TFF进行一步反应，以上的值则分别为38.63％，14.06％和27.27％。而两步反应后，以上的值则为63.20％，29.74％和73.80％。
为了证实酶膜反应器的作用效果，需对水解产物的功能、生物活性以及免疫特性进行研究。对最优条件下一步(10 kDa或3 kDa)或两步(先10 kDa后3kDa)酶膜反应得到的水解产物经非极性苯乙烯基大孔吸附树脂(MAR)吸附，用去离子水洗涤除去碱，然后分别以25％、50％和95％(v/v)的乙醇阶段解吸。虽然酶膜反应的水解度是分批式水解的2～3倍，但前者透过产物中的灰份含量低于后者。采用MAR吸附乙醇解吸的处理方式显著降低了水解产物的灰份含量，蛋白质回收率也相应较高。
和天然WPI相比，所有未脱盐回流产物的竞争性抑制酶联免疫吸附测定(Cl-ELISA)活力均更高。本研究引入了IC<,50>来分析ELISA的实验结果。脱盐后的一些组分的ELISA活力有良好的量效关系。与天然的WPI相比，所有水解产物均有更高的等电点(p1)溶解性，而脱盐组分具有更强的2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl(DPPH)自由基清除能力。两步反应的透过产物经脱盐处理后具有较低的ELISA活力和较好的p1溶解性，以及最高的DPPH自由基清除能力。采用PCA处理数据，三个主成分累计方差贡献率达到水解产物原始信息的86.67％。其中，水解产物的相对分子质量影响最显著(PCI=57.35％)，其次为ELISA活力(PC2=18.90％)和抗氧化能力(PC3=10.43％)。因此，在切向流酶膜反应器中，以优化的条件水解WPI 5 h可制备得到具有一定活性的乳清蛋白水解物。经大孔吸附树脂脱盐脱苦后，水解产物中盐含量和免疫活力均较低，在低pH值下溶解性高，具有更好的风味特性，这使其可应用于低过敏原性配方及功能性食品中。与天然WPI以及分批式反应制得的水解产物相比，经酶膜反应水解加工处理得到的水解产物呈现出更好的品质。