研究背景及意义:皮肤是机体最大的外部器官,极易遭受各类创伤。因此,皮肤的损伤修复一直是医学领域研究的热点与难点问题。皮肤创面的愈合是一个复杂的过程,包括了止血期、炎症期、增殖期和重塑期在内有序发生并且相继重叠的四个阶段。除了传统的皮片/皮瓣移植外,组织工程皮肤、生长因子、光治疗等新型手段也被应用于皮肤创伤的修复治疗。但由于治疗费用昂贵,材料储存条件苛刻,治疗效果因人而异,涉及医学伦理问题,存在潜在致癌风险等一系列缺陷以及患者与日俱增的需求,研究并开发新的皮肤缺损治疗方法具有重要的意义。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分,不仅能够快速应答、抵御外界物质对机体的入侵,同时在多种组织器官的损伤后修复和再生过程中发挥关键的调控作用。巨噬细胞除了能够在外周神经、脑、肾脏、肌肉及骨骼损伤过程中分泌生长因子,激活信号通路并促进其修复过程,还通过发挥其吞噬作用,清除受损的坏死组织,防止损伤进一步扩大。缺乏巨噬细胞会直接干扰有尾两栖类脊椎动物附肢再生过程中芽基组织的生成,进而影响整个修复过程,使受损部位不能够再生出正常附肢。但在皮肤组织损伤修复过程中,巨噬细胞发挥的作用尚不明确。基于这些背景,本研究首先对小鼠背部全层皮肤缺损修复过程中巨噬细胞的分布情况进行了观察,随后利用剔除巨噬细胞小鼠模型,在组织水平、基因水平和蛋白水平探讨巨噬细胞数目降低对修复过程的影响。其次,使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulatin Factor,GM-CSF)对小鼠进行皮下注射,系统性提高其体内单核-巨噬细胞系的增殖和分化水平,观察经该方法处理后小鼠皮肤缺损愈合的情况并检测与修复相关的生长因子表达水平的变化,进一步分析巨噬细胞数量增多对皮肤缺损修复的影响。最后,利用液相质谱-色谱串联技术(Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)鉴定修复早期具有显著表达差异的蛋白分子,分析这些蛋白参与的生物学过程,评价注射GM-CSF后对小鼠皮肤损伤修复过程造成的影响,为阐明巨噬细胞在皮肤创伤愈合过程中的作用和进一步探索开发新的治疗手段提供有力的理论基础。实验方法:本研究共分为四部分:1.制备小鼠背部全层皮肤缺损,在不同时间点对其伤口进行大体拍照和组织学切片染色,观察其缺损修复情况及再上皮化水平,同时分析皮肤组织内的巨噬细胞分布及数量变化情况;2.使用Liposome Clodronate(L-clod)处理小鼠,建立剔除巨噬细胞小鼠模型,通过基于组织学、基因和蛋白水平的多种实验技术方法,以Liposome PBS(L-PBS)处理组为对照,分析缺乏巨噬细胞对皮肤损伤修复造成的影响;3.对小鼠予以皮下注射GM-CSF药品,刺激其体内单核-巨噬细胞系的分化和增殖,利用流式细胞术分析其循环系统中的巨噬细胞数目变化情况,随后评估该方法对皮肤损伤修复过程产生的影响。最后,利用分子生物学手段,检测修复过程中与再生相关的生长因子在基因水平的表达趋势;4.对GM-CSF注射组及其对照组小鼠在0 dpi(days post injury,损伤后天数)、3 dpi、6 dpi时间点的皮肤组织进行总蛋白提取,使用LC-MS/MS技术,对样品蛋白进行鉴定,测定其丰度并进一步分析相关蛋白分子所参与的具体生物学过程。实验结果:1.小鼠背部皮肤受到损伤后,于5 dpi生成大量肉芽组织,10 dpi时再生出直径10 mm大小的圆形缺损上皮,15 dpi时肉芽组织基本消失,修复过程完成。在此期间,巨噬细胞始终可见于受损皮肤组织内并均匀分布在其中。2.使用L-clod处理小鼠后,小鼠皮肤组织内的巨噬细胞数目减少。与其相应的对照组相比,小鼠的伤口愈合速度变慢,修复过程中再上皮化水平明显降低。虽然对比新生皮肤组织的胶原含量发现,两组小鼠的胶原容积率没有区别,但剔除巨噬细胞的小鼠的胶原沉积速率较慢,且胶原纤维束的重排及组织内重塑过程相对滞后。对相关生长因子进行基因和蛋白水平的检测发现,在注射L-clod后,修复过程中实验组小鼠皮肤组织内大部分炎症因子和生长因子的表达下调。3.向小鼠皮下注射GM-CSF后,其外周血内单核-巨噬细胞数目显著升高。与此同时,观察其皮肤损伤修复过程发现,实验组小鼠的伤口较对照组小鼠愈合速度更快,再上皮化水平也明显高于对照组小鼠。除此之外,在修复完成时,GM-CSF注射组小鼠皮肤组织内的胶原含量较低,意味着其疤痕组织相对更小。分析相关生长因子在基因水平的表达趋势发现,实验组小鼠与血管再生、上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)及细胞外基质(Extra Cellular Matrix,ECM)降解相关的基因表达水平都不同程度地上调。4.GM-CSF注射组及其对照组小鼠在0、3、6 dpi时间点的皮肤组织蛋白LC-MS/MS分析结果显示,实验组小鼠体内多种蛋白分子表达水平上调,当中的一大部分参与了包括细胞粘附与趋化迁移、抗原处理与呈递、溶酶体、凝血反应以及多种修复相关细胞因子信号通路激活的相关活动。这些蛋白分子之间也存在非常紧密的相互作用。结论:以上实验结果表明,巨噬细胞参与并调控了皮肤损伤修复过程中的多种生物学过程,对皮肤创伤后愈合具有非常重要的作用。使用GM-CSF注射液刺激小鼠外周血循环系统单核-巨噬细胞系的分化和增殖,能够在一定程度上提高与修复相关的多种蛋白分子的表达水平,进而调控并激活与炎症、迁移、增殖等相关的一系列信号通路。这些生物学过程有益于促进小鼠的全层皮肤损伤修复速度,加快其再上皮化过程并减少疤痕组织的生成。本实验结果初步验证了注射GM-CSF系统性提升巨噬细胞数目后,促进皮肤损伤修复的可能性,为开发该方法作为一种新的伤口愈合治疗手段提供了一定理论基础。