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[研究目的]牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是间充质来源的干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),是骨组织工程种子细胞的重要来源之一[1-3]。骨组织再生过程复杂,受多种细胞因子及信号通路的调节[4]。趋化因子CXCL12可通过在机体损伤部位募集MSCs促进组织的修复和再生,是重要的MSCs调节因子之一[5-6],最新研究显示CXCL12可能直接参与组织修复中的血管再生过程[7-8],但CXCL12调控PDLSCs促进血管生成的作用还未见相关报道。因此,本研究通过体内外实验,探讨人PDLSCs过表达CXCL12后成血管相关因子的表达情况以及促进大鼠颅骨标准骨缺损修复的作用,希望可以为骨组织再生的临床治疗提供一定的理论依据和实验基础。[研究方法]1.人牙周膜干细胞的分离、培养以及鉴定:酶消化法分离培养人牙周膜干细胞,油红O脂类染色及碱性磷酸酶染色确定PDLSCs的多向分化潜能,流式细胞术检测PDLSCs的间充质干细胞相关标志物表达,明确原代培养的PDLSCs具有间充质干细胞特性及多向分化潜能。2.过表达CXCL12促进人PDLSCs成血管相关因子表达的体外研究:利用慢病毒转染技术将CXCL12慢病毒载体转染进入人牙周膜干细胞,转染后1天、4天、7天、14天利用real-time PCR检测成血管相关因子的mRNA表达水平,Western Blot蛋白免疫印迹实验检测成血管相关因子的蛋白表达水平;病毒转染后4小时和48小时,利用Matrigel类毛细血管形成实验检测类毛细血管样结构形成能力。3.过表达CXCL12促进人PDLSCs成血管相关因子表达的体内研究:构建SD大鼠颅骨标准骨缺损动物模型,利用β-磷酸三钙(β-TCP)体外构建细胞材料复合体,植入SD大鼠颅骨缺损部位;动物实验共分为4组:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP组,Lenti-GFP/PDLSCs/β-TCP组,PDLSCs/β-TCP组,β-TCP组。2个月后,通过苏木素伊红染色检测缺损部位的新骨形成,micro-CT对缺损部位形成的新骨进行形态学分析,免疫组织化学检测缺损部位的成血管相关因子的表达情况。[结果]1.酶消化法成功获得PDLSCs,流式细胞术分析发现该细胞高表达CD90、CD44和CD105,低表达CD146,不表达CD45,表明其具有间充质来源干细胞特性;油红O脂类染色及碱性磷酸酶染色,结果为阳性,确定所获得的PDLSCs具有成脂及成骨的多向分化潜能。2.当M0I=5时,慢病毒转染效率最高,转染效率大于90%。real-time PCR结果显示:与对照组相相比,CXCL12过表达组中成血管相关因子VEGF、bFGF、PLGF和SCF的mRNA表达水平较高,且具有明显统计学差异(P<0.05);Western Blot结果显示:病毒转染后,各组内成血管相关因子VEGF、bFGF、PLGF和SCF的表达随着时间的推移而逐渐增高,而CXCL12过表达组中成血管相关因子蛋白表达水平明显高于对照组,且具有明显统计学差异(P<0.05);Matrigel类毛细血管形成实验结果显示:转染后48小时,CXCL12过表达组可以形成更明显的类毛细血管样结构。3.SD大鼠颅骨标准骨缺损模型构建成功;苏木素伊红染色结果显示:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP组中缺损部位被大量的红染物质填充,提示有更多的新骨样结构形成;micro-CT分析结果提示:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP组中骨缺损部位几乎被新骨充填,BMD值,BV/TV值均高于对照组,且具有明显的统计学差异(P<0.05);免疫组织化学结果显示:Lenti-CXCL 12-GFP/PDLSCs/β-TCP组缺损部位有更多的成血管相关因子VEGF、bFGF、PLGF和SCF的表达,统计学差异明显(P<0.05)。[结论]1.CXCL12可以促进牙周膜干细胞高表达成血管相关因子VEGF、SCF、bFGF、PLGF。2.CXCL12转染PDLSCs后可促进大鼠颅骨标准骨缺损修复,成血管相关因子VEGF、SCF、bFGF、PLGF表达增强。3.本实验结果为牙周组织再生的临床治疗提供一定的实验基础和理论依据。