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前言癌症的化学治疗包括使用天然的或合成的化学试剂来抑制肿瘤的形成。由于姜黄素在印度和中国的药用价值,它已被研究于抗炎、抗血管形成、抗氧化、治疗外伤以及抗癌方面。作为一个天然抗癌药物,姜黄素已被人们广泛关注。最近研究表明姜黄素在癌症发生的三个阶段都发挥着抗癌作用,这是由于它能够抑制蛋白激酶C(PKC)、EGFR酪氨酸激酶和IkappaB激酶等。进而抑制转录因子核因子kappaB(NF-kappaB)的活化以及癌基因包括MAPKs、ERK、PI3K和Akt等的表达。而且,在许多癌症发现的过表达的原癌基因cyclin D1的表达也被姜黄素抑制。这些表明姜黄素可以通过阻滞靶细胞中的信号转导通路来抑制肿瘤的形成。p21活化激酶(PAKs)是Rho家族GTP酶信号通路中的重要调节因子,参与细胞骨架形成和细胞移动以及肿瘤的发生等生物学过程。PAK1的异常活化和随后的cyclin D1高表达在肿瘤发生中发挥了重要的作用。而且,PAK1通过依赖NFkB信号通路调节着cyclin D1转录。因此,属于蛋白激酶的PAKs,,是肿瘤治疗的重要靶点,而且由于其含有保守的ATP结合口袋,它被认为具有重要的药物研究价值。目前许多以PAKs,尤其以PAK1为靶点的小分子抑制剂被报道。但是,这些ATP竞争抑制剂大部分都是非选择性的。近来,有报道认为ATP竞争性抑制剂通过结合激酶的较不保守区域(非活化构象),具有不寻常的高选择能力,如Gleevec。也有报道IPA-3——一个高度特异、有力的非ATP竞争性抑制剂,可以以PAK1的调节域为靶点而发挥作用。总之,越来越多的数据表明,PAK1在肿瘤的增殖和转移过程中起作用,因此针对PAK1的抑制剂是一种新的肿瘤治疗方法。在这里,我们报道了姜黄素在胃癌细胞中以PAK1为靶点,提出了姜黄素抑制人胃癌细胞增殖和侵袭一个新的机制。实验材料与方法一、姜黄素抑制胃癌细胞的增殖和侵袭1、用Western blot方法检测BGC823、SGC7901、MKN1和MGC803四个细胞系中PAK1蛋白表达情况。2、用MTT方法检测姜黄素对细胞生长的抑制作用。3、用Transwell方法检测姜黄素对细胞侵袭的抑制作用。二、姜黄素抑制胃癌细胞从G1期向S期转化,并下调了cyclin D1在mRNA和蛋白水平的表达1、用细胞流式方法检测药物对胃癌细胞周期的抑制作用。2、用Western blot方法检测药物对细胞中cyclin D1蛋白抑制情况;用RT-PCR方法检测药物对细胞中cyclin D1在RNA水平的抑制情况。三、姜黄素下调HER2(Erb2)表达以及PAK1的激酶活性1、联合用免疫沉淀和激酶分析的方法检测药物对体内PAK1激酶活性的抑制作用。2、用激酶分析方法检测药物对体外的PAK1激酶抑制情况。3、用Western blot方法检测药物对胃癌细胞HER2和cyclin D1蛋白的抑制情况4、用计算机分子模拟对接的方法验证姜黄素作为ATP竞争抑制剂的可能性四、瞬时沉默胃癌细胞中HER2(Erb2/neu)后姜黄素下调PAK1的激酶活性1、胃癌细胞中转染HER2的siRNA,用Western blot方法验证HER2的干扰情况。2、胃癌细胞被HER2的siRNA干扰后,用激酶分析方法检测的姜黄素对PAK1激酶活性影响。实验结果一、姜黄素抑制胃癌细胞的增殖和侵袭1、在BGC823、SGC7901、MKN1和MGC803这四个细胞系中检测PAK1蛋白表达,结果发现PAK1有较高的蛋白水平表达,尤其在BGC823细胞中PAK1表达最高。2、用MTT方法检测药物抑制细胞增殖情况,结果发现药物抑制作用具有剂量依赖性。3、姜黄素可以抑制胃癌细胞的侵袭转移。二、姜黄素抑制胃癌细胞从G1期向S期转化,并下调了cyclin D1在mRNA和蛋白水平的表达1、姜黄素对胃癌细胞周期有抑制作用,抑制胃癌细胞从G1向S期的转化。2、姜黄素可以下调细胞周期蛋白cyclin D1的蛋白和RNA的表达水平。三、姜黄素下调HER2(Erb2)表达以及PAK1的激酶活性1、姜黄素抑制了胃癌体内由EGF介导的PAK1的激酶活性;并可以作为ATP竞争抑制剂抑制体外PAK1的激酶活性。2、姜黄素使HER2和cyclin D1蛋白表达水平下降。3、计算机分子模拟对接验证姜黄素可以作为ATP竞争抑制剂。四、瞬时沉默胃癌细胞中HER2后,姜黄素仍能够抑制EGF介导的PAK1激酶活性1、比较胃癌细胞BGC823细胞在转染HER2的siRNA后发现48小时的沉默目的基因的效果明显。2、沉默胃癌细胞中HER2后,姜黄素仍可以有效的抑制PAK1激酶活性。结论姜黄素能够下调HER2蛋白表达,并能抑制由EGF介导的PAK1的激酶活性。姜黄素对PAK1激酶活性的下调是由于其阻滞了PAK1上游EGF通路,以及药物可以作为ATP竞争抑制剂的抑制作用,药物随后对cyclin D1表达的抑制进一步阻滞了细胞由G1期向S期的转化。综合以上药物的抑制作用,致使细胞的增殖与侵袭受到抑制。