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第一部分:人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/MX的建立及耐药性逆转的研究目的:探讨乳腺癌耐药蛋白(BCRP)抑制剂白杨素(Chrysin)逆转乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX的耐药性。方法:采用米托蒽醌浓度逐步增加的方法诱导建立MCF-7/MX耐药细胞株;绘制细胞生长曲线、计算细胞倍增时间来观察MCF-7/MX细胞在体外的生长情况;应用Western blot方法检测细胞的BCRP蛋白表达;利用MTT比色法观察Chrysin联合Mitoxantrone对MCF-7/MX细胞增殖的影响。结果:通过逐步增加培养液中米托蒽醌浓度(8nM、20nM、40nM、80nM、100nM)可建立乳腺癌耐药细胞株MCF-7/MX。耐药细胞株生长较亲本细胞慢,其群体倍增时间为37.87小时,较亲代细胞延长了11.31小时。MTT比色法测定结果显示,耐药细胞株对米托蒽醌的耐药指数为38,明显高于亲本细胞。在诱导过程中随着药物浓度的增加,BCRP蛋白表达量逐渐增加,而在亲本细胞中BCRP蛋白则不表达。相应浓度的米托蒽醌(终浓度为0nM,40nM,80nM ,100nM)作用后,BCRP蛋白相对表达量为0.485±0.010、0.717±0.079、1.145±0.128、1.317±0.163,组间比较有差异性(P<0.05)。Chrysin(终浓度为2.5μM、5μM)作用48小时后,MCF-7/MX细胞对米托蒽醌IC50分别为1.851±0.02μM、0.62±0.217μM,与未加Chrysin的对照组(19.954±1.193μM)之间有差异性(P<0.05)。但对于MCF-7细胞,不同浓度的Chrysin(终浓度为0μM、2.5μM、5μM)作用后,细胞对米托蒽醌的IC50分别为0.532±0.004μM、0.493±0.023μM、0.471±0.051μM,各组间没有差异性(P>0.05)。结论:1.MCF-7经梯度浓度米托蒽醌诱导可建立耐药细胞株MCF-7/MX;2.从细胞毒性实验见MCF-7/MX细胞对米托蒽醌高度耐药;3.由BCRP蛋白介导,白杨素能逆转MCF-7/MX细胞耐药性。第二部分:白杨素对人乳腺癌MCF-7/MX中癌干细胞亚群作用目的:探讨白杨素对MCF-7/MX细胞中乳腺癌干细胞亚群CD44~+CD24~-的影响。方法:实验分为:1.流式细胞计数仪检测MCF-7、MCF-7/MX细胞株CD44~+CD24~-细胞的比例及在米托蒽醌(终浓度为100nM)作用48小时后的CD44~+CD24~-细胞比例;2.流式细胞计数仪检测MCF-7/MX细胞株用白杨素(终浓度为10-2μM、10-1μM、100μM、101μM)作用48小时后的CD44~+CD24~-细胞比例;3.细胞免疫荧光法和流式细胞计数仪检测培养液中含有米托蒽醌(终浓度为100nM)的MCF-7/MX细胞,加入白杨素(终浓度为10-2μM、10-1μM、100μM、101μM)作用48小时后CD44~+CD24~-细胞比例。结果:流式细胞仪检测MCF7、MCF7/MX细胞几乎均为CD44阳性,MCF7中表达CD44~+CD24+细胞比例为95.041±2.146%,MCF7/MX中CD44~+CD24+细胞比例为94.275±1.039%。表达CD44~+CD24~-的细胞仅为少部分,MCF-7中CD44~+CD24~-细胞比例为1.885±0.195%,MCF-7/MX的CD44~+CD24~-细胞比例为3.128±0.325%,两者有显著差异性(P<0.05)。米托蒽醌(终浓度为100nM)作用MCF7或MCF7/MX细胞48小时后,MCF-7/MX中CD44~+CD24~-比例为3.254±0.128%与作用前没有差异性(P>0.05),而MCF-7中CD44~+CD24~-细胞比例为2.724±0.163%与作用前有差异性(P<0.05)。在含有米托蒽醌(100nM)的培养消液中,细胞免疫荧光法和流式细胞计数仪检测Chrysin(终浓度为10-2μM、10-1μM、100μM、101μM)作用MCF-7/MX细胞48小时后CD44~+CD24~-细胞的比例分别为2.684±0.226%、1.907±0.179 %、1.414±0.112 %、1.448±0.057%低于对照组3.128±0.325%(P<0.05)。各组间比较均有显著差异性,呈浓度依赖关系(P<0.05),但是我们发现101μM组与100μM组间无显著差异性(P>0.05)。结论:1.流式细胞计数仪和细胞免疫荧光法证实白杨素可上调米托蒽醌对MCF-7/MX中癌干细胞亚群CD44~+CD24~-细胞的细胞毒性;2.白杨素单独作用对CD44~+CD24~-细胞无效,揭示白杨素可作为CD44~+CD24~-细胞的化疗增敏剂。