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树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体内功能最强大的专职抗原呈递细胞（Antigen presenting cell,APC）,也是目前发现唯一能直接激活初始型T细胞的APC。DCs广泛存在于胃肠道中,是肠道黏膜免疫系统主要的守卫者,在调节黏膜免疫应答及免疫耐受中扮演着重要角色。近年来研究发现,多种微生物能影响DCs的分化和成熟,包括肠道乳酸菌。乳酸菌具有免疫调节作用,可以调节多种免疫细胞如DCs和NK,促进其生长和发育。本研究以鸡肠道约氏乳酸杆菌（Lactobacillus johnsonii,L.johnsonii）为研究对象,研究其对鸡骨髓源树突状细胞（Chicken bone marrow-derived dendritic cells,ChBM-DCs）的影响。主要从DCs的形态、细胞表面分子表达情况、吞噬能力、混合淋巴细胞反应（Mixed lymphocyte reaction,MLR）,Toll样受体（Toll-like receptor,TLRs）、MyD88/NF-κB信号通路分子和细胞因子基因转录水平等方面进行评价。具体研究内容和结果如下:为获得chBM-DCs,我们选取4-6周龄SPF鸡,取其股骨和胫骨,利用Histopaque-1119淋巴细胞分离液分离得到鸡骨髓源单核细胞,平铺6孔板,加入rcGM-CSF和rcIL-4细胞因子,置于39℃、5%CO2培养箱中诱导培养。诱导培养4 d时,经倒置显微镜观察可看见大量细胞集落形成,培养至6 d时,细胞集落松散贴壁,获得了未成熟的chBM-DCs。将培养至6d的细胞分成3组:阴性对照组,加入相等量的基础RPMI-1640;阳性对照组,加入终质量浓度为200 ng/mL的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）;试验组,加入经紫外灭活浓度为100μg/mL的L.johnsonii,继续培养24 h。结果显示:通过流式细胞术检测诱导培养1 d和7 d的鸡骨髓源单核细胞细胞表面分子表达,结果显示:第1 d时,细胞表面不表达CD11c和MHC-II分子;第7 d,未刺激组、LPS刺激组和L.johnsonii刺激组细胞表面高表达CD11c,纯度达70%以上;未刺激组chBM-DCs低表达CD40和CD86,细胞处于未成熟状态,而LPS刺激组和L.johnsonii刺激组,CD40和CD86表达量上调,细胞被刺激成熟。经RT-qPCR检测chBM-DCs中CD80、CD86和DEC-205 mRNA转录水平,结果发现,与未刺激组相比,LPS刺激组和L.johnsonii刺激组CD80、CD83和DEC-205的mRNA表达量上调,其中CD83的mRNA水平差异极显著（P<0.01）。收集诱导培养2 d、4 d、6 d和7 d未经刺激的细胞以及经LPS和L.johnsonii刺激24 h的chBM-DCs,采用中性红检测其吞噬能力,结果显示,鸡骨髓单核细胞经rcGM-CSF和rcIL-4诱导培养2 d、4 d、6 d和7 d后,吞噬能力先增强后降低,第6 d时吞噬能力达到最大;与未刺激的chBM-DCs相比,经LPS和L.johnsonii刺激的chBM-DCs吞噬能力降低,但差异不显著（P>0.05）。以未成熟的chBM-DCs以及经LPS（200 ng/mL）和L.johnsonii（100μg/mL）刺激成熟的chBM-DCs为刺激细胞,同种异体T淋巴细胞为反应细胞,分别按刺激细胞:反应细胞为1:1、1:10、1:100的比例进行混合,采用CCK-8试剂盒检测T细胞的增殖能力。结果显示,经LPS和L.johnsonii刺激成熟的chBM-DCs均能够诱导T细胞增殖,与对照组相比差异极显著（P<0.01）,刺激指数随着细胞数的减少而降低。采用LPS和L.johnsonii刺激chBM-DCs,分别于刺激后6 h、12 h和24 h收集细胞,以未经刺激的chBM-DCs作为对照,通过RT-qPCR方法检测TLR2/4/5/15和MyD88/NF-κB信号通路分子等mRNA的转录水平,以观察不同刺激时间L.johnsonii对chBM-DCs的影响。结果显示,与对照组相比,L.johnsonii在各时间段都能够促进TLR2、TLR4和TLR5 mRNA表达量增加（fold change>1）,特别是TLR5,而TLR15 mRNA的表达量下降（fold change<1）;与LPS组相比,TLR2在L.johnsonii刺激6 h和12 h后mRNA的表达量分别差异极显著（P<0.01）和差异显著（P<0.05）,TLR4在L.johnsonii刺激6 h后mRNA的表达量差异显著（P<0.05）,而TLR5在各时间段mRNA的表达量均差异极显著（P<0.01）。在LPS组和L.johnsonii组,TLR15的mRNA表达量均低于未刺激组（fold change<1）。同时,L.johnsonii在各时间段都能够促进MyD88/NF-κB信号通路mRNA表达量增加（fold change>1）。采用不同浓度的L.johnsonii（1μg/mL、10μg/mL和100μg/mL）刺激chBM-DCs,于刺激后6 h、12 h和24 h收集细胞,通过RT-qPCR方法检测Th1型和Th2细胞因子、促炎性细胞因子和趋化因子基因的转录水平,以分析L.johnsonii不同浓度和不同刺激时间对上述细胞因子的影响。结果显示,与未刺激组相比,在各个时间段低浓度L.johnsonii（1μg/mL）刺激的chBM-DCs细胞因子和趋化因子（CXCLi1）mRNA相对表达量均降低（fold change<1）;中高浓度的L.johnsonii（10μg/mL和100μg/mL）刺激chBM-DCs后,在各个时间段Th1型细胞因子、促炎性细胞因子和趋化因子mRNA相对表达量均高于未刺激组（fold change>1）,而仅高浓度L.johnsonii（100μg/mL）组才能够促进Th2型细胞因子mRNA相对表达量增加（fold change>1）,LPS组在各个时间段均不能促进Th2型细胞因子（IL-4）mRNA相对表达量增加（fold change<1）。高浓度L.johnsonii组在各个时间段IL-12、IFN-γ、IL-1β和IL-6mRNA相对表达量均高于LPS组（P<0.01）。此外,Th1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α）以及促炎性细胞因子和趋化因子mRNA的表达量随着刺激时间的增加而降低,而Th2型细胞因子随着刺激时间的增加而增加。以上结果表明,L.johnsonii能够刺激chBM-DCs成熟,并且以剂量依懒性和时间依赖性方式影响chBM-DCs细胞因子和趋化因子的产生,同时可以调节Th1/Th2平衡,维持机体稳态。