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奶牛繁殖障碍性疾病多发于妊娠早期,使相关产业蒙受巨大经济损失。对妊娠早期子宫内膜免疫状态的研究,可为奶牛生产实践提供理论依据。妊娠早期奶牛子宫内膜呈现一定的免疫应答,NF-κB处于激活状态,环氧合酶、细胞因子表达升高,或参与子宫内膜重塑、胎盘形成,或参与抵御外来病原入侵。与此同时,子宫组织免疫处于平衡状态,此阶段免疫应答过度激活造成炎症反应,是妊娠失败的主要原因之一。孕激素是奶牛妊娠早期血液中浓度变化最大的激素之一,在妊娠约45天时,其在血液中循环浓度可达到10 ng/m L左右。研究表明,孕激素可诱导子宫内膜上皮细胞（b EECs）产生TNF-α、IL-1β等细胞因子。然而,有关妊娠早期孕激素是如何诱导b EECs产生免疫应答、对应的调控机制有待进一步阐明。核受体共激活因子3（NCOA3）是NF-κB、AP1、p53等转录因子以及孕激素受体的共激活因子。NCOA3在妊娠早期子宫组织中的高表达,是胚胎着床、胎盘形成等生殖过程顺利进行的关键。mi RNAs广泛参与生理、病理过程,其通过靶向3’端非翻译区（3’-UTR）,沉默基因表达。本实验通过Traget Scan选出靶向NCOA3 3’-UTR且综合评分高的mi R-20b,随后,以妊娠60天和未孕奶牛子宫组织为研究对象,探究妊娠早期奶牛子宫内膜免疫状态的改变与mi R-20b、NCOA3之间的关系。本实验继而以b EECs为体外实验研究对象,揭示孕激素诱导b EECs免疫应答与NCOA3/NF-κB轴之间的关系,验证了mi R-20b与NCOA3靶向关系,探讨了子宫组织中高表达的mi R-20b对子宫内膜免疫应答的抑制作用。以上研究为阐明妊娠早期奶牛子宫内膜免疫状态调控机制提供了理论依据,主要研究结果与结论如下:1.妊娠早期（60天）奶牛子宫内膜呈现免疫应答现象。H&E结果表明,妊娠早期奶牛子宫腺结构完整,未发现明显断裂、破碎等病理学变化。IHC、RT-q PCR表明,60天子宫组织中,COX-2、TNF-α和IL-1β表达显著高于未孕组（p<0.05）,且子宫内膜NCOA3 m RNA和蛋白表达水平显著上调（p<0.01）。2.孕激素通过NCOA3/NF-κB轴诱导b EECs免疫应答。CCK8检测结果表明,孕激素浓度小于等于50 ng/m L时,对b EECs细胞活力没有显著影响;而100ng/m L浓度会对其活力产生显著抑制作用（p<0.05）。10 ng/m L孕激素刺激b EECs,NCOA3 m RNA和蛋白表达水平均在12 h时间点显著上调（p<0.05）。NF-κB信号通路中p-IκBα和p-p65蛋白的表达水平随着孕激素作用时间的延长逐步上升。NF-κB下游基因TNF-α、IL-1βm RNA表达水平和COX-2蛋白表达水平均在12 h显著上调（p<0.01）。使用si RNA沉默b EECs中NCOA3表达,论证孕激素通过NCOA3/NF-κB轴激活b EECs中细胞因子和COX-2表达。实验结果表明,沉默NCOA3后,孕激素诱导的TNF-α和IL-1βm RNA表达水平和蛋白分泌水平受到显著抑制（p<0.05）,COX-2蛋白表达显著下调（p<0.05）,IκBα和p65的磷酸化水平受到显著抑制（p<0.05）。3.mi R-20b靶向NCOA3调控孕激素诱导b EECs免疫应答。妊娠早期奶牛子宫内膜中mi R-20b表达水平显著高于未孕奶牛组（p<0.05）。使用不同浓度孕激素刺激b EECs 12 h,发现10 ng/m L孕激素组mi R-20b相对表达量上升幅度最大（p<0.05）。使用10 ng/m L孕激素作用不同时间,发现mi R-20b在8 h和12 h两个时间点表达量显著高于对照组（p<0.05）。Target Scan预测出mi R-20b靶向NCOA3。双荧光素酶报告系统分析表明,mi R-20b mimics可以显著下调野生型NCOA3 3’-UTR的荧光素酶活性（p<0.01）。过表达mi R-20b可显著降低NCOA3蛋白表达水平（p<0.05）,而沉默内源性mi R-20b可以促进NCOA3蛋白表达水平（p<0.05）。过表达mi R-20b显著抑制孕激素诱导的TNF-α和IL-1βm RNA表达水平和蛋白分泌水平（p<0.05）、COX-2蛋白表达水平（p<0.05）以及p-IκBα和p-p65蛋白表达水平（p<0.05）。结果表明,妊娠早期奶牛体内高水平孕激素诱导mi R-20b高表达,mi R-20b通过靶向NCOA3阻断NF-κB信号通路,抑制b EECs免疫应答。该过程应是妊娠早期奶牛子宫免疫系统自我调控的机制之一,可能参与子宫组织重塑、子宫免疫微环境改变、胎盘形成等过程。