再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的制备、改性及其生物相容性评价

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纤维素是地球上来源最丰富的可再生天然高分子,具有良好的生物相容性和生物降解性,并且对细胞及组织无毒副作用,因此纤维素及其衍生物在生物材料领域受到越来越多的关注。基于其优良的性能,纤维素已被制备成膜材料、纤维材料、海绵材料和微球材料。纤维素基微球以纤维素为结构骨架,具有生物可降解性、生物相容性,在色谱填充物、蛋白质固定、细胞载体和药物载体/释放系统等方面有广阔的应用前景,因此对新型纤维素微球材料的研发和应用探索具有重要意义。在过去的几十年中,研究者报道了很多基于滴入和分散技术制备纤维素微球。其中高压静电技术是一种改进的基于滴入技术的方法,它可以用来制备尺寸均一、粒径可控的微球,是一种相对环保,安全,方便和连续的方法,在生物医学领域有广泛的应用。因此,采用高压静电法制备基于纤维素的微球材料是一种简便易行的方法。大豆分离蛋白是一种来源丰富的具有多种生物学活性的植物蛋白,具有良好的生物相容性和生物降解性。同时,由于大豆分离蛋白具有良好的加工性能,大豆分离蛋白本身及其衍生物已加工为膜(片)材料、凝胶材料、纤维材料和海绵材料等多种类型的材料。作为生物材料,它们在药物释放、伤口敷料和组织工程等方面都可能具有极大的应用潜能。实验室前期研究表明,利用大豆分离蛋白改性纤维素制备纤维素/大豆分离蛋白复合膜和复合海绵,其具有较好的力学性能,生物相容性,生物安全性和生物降解性能。由此,本论文以纤维素和大豆分离蛋白这两种天然高分子为主要原料,采用高压静电法制备了一系列再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球,系统地评价这类复合微球的结构和理化性能,细胞相容性和血液相容性;针对其性能的不足,进一步对再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球进行表面肝素化修饰改性,评价了其理化性能及生物学性能;并且评价了肝素化复合微球与大鼠骨髓间充质干细胞间的相互作用,为进一步开发和拓展其在生物医学领域的应用提供理论和实验依据。本论文的主要内容包括以下几个方面:(1)高压静电法制备再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球及其结构和理化性能表征:以纤维素和大豆分离蛋白为主要原料,利用NaOH/尿素水溶液体系低温下直接溶解纤维素,采用高压静电法制备了一系列尺寸由微米到毫米级的再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球,通过光学显微镜、扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶红外光谱检测(FT-IR)、X-射线衍射分析(XRD)、固体核磁(13C NMR)、水接触角测试、吸水率测试、热失重和热分解测试等方法表征它们的结构和物理性能。结果表明,制备的再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球表现出较好的球形结构,表面为纳米尺寸小孔。干态下粒径范围从300到1500μm,微球尺寸分布均一,并且可以通过改变工艺参数,如控制电压值和纤维素/大豆分离蛋白的比率来实现微球粒径的可控。在复合微球的再生过程中,纤维素和大豆分离蛋白之间形成强的氢键相互作用,复合微球表面的亲/疏水性可以通过大豆分离蛋白在复合微球中的含量来调整,而且大豆分离蛋白的引入并没有改变纤维素良好的热稳定性能,复合微球作为生物材料可以在121℃进行灭菌。由此,对于制备再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球,高压静电法是一种简单易行、绿色环保并且安全可控的方法。(2)再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的生物相容性评价:分别通过细胞活性(MTT法)、体外细胞培养、溶血实验、红细胞孵育、血小板粘附实验及抗凝血实验对再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的细胞相容性和血液相容性进行了评价。结果表明,再生纤维素/大豆蛋白质复合微球无明显的细胞毒性,L929细胞可以在复合微球表面正常生长和增殖,并且大豆分离蛋白含量10%和30%的复合微球表面上粘附的细胞更密集,多数呈梭形,具有较好的细胞相容性。再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球无明显的抗凝血性能,与血液接触不会发生溶血。(3)再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的肝素化及其生物相容性评价:对已合成的一系列的再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球进行了表面肝素化修饰改性。对表面肝素化的复合微球的结构与物理性能、细胞相容性和血液相容性进行了评价。结果表明肝素确实被结合到了再生复合微球表面,表面结合的肝素含量随大豆分离蛋白含量增高而增大。表面肝素化增强了复合微球表面的亲水性能。细胞相容性评价的结果表明,表面肝素化未影响再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的细胞相容性,材料无细胞毒性,并且很好地改善了L929细胞在其表面生长的形态。血液相容性评价结果表明,复合微球表面肝素化后降低了其发生溶血的可能,改善了其血液相容性,并且表面肝素化明显地提高了再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的抗凝血性能。(4)肝素化再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球对大鼠骨髓间充质干细胞的细胞相容性及体外成骨分化的影响:通过原代培养获得了高纯度的大鼠骨髓间充质干细胞,并且通过细胞活性(MTT法)、体外细胞培养、体外成骨诱导实验评价了肝素化再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球对BMSCs的细胞相容性及体外成骨分化的影响。结果表明,BMSCs可以在大豆蛋白含量占30%和50%的表面肝素化再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球的表面较好地黏附和增殖。说明大豆分离蛋白含量为30%和50%的表面肝素化复合微球对BMSCs无明显的细胞毒性,具有较好的细胞相容性。体外成骨诱导分化实验结果表明,大豆分离蛋白含量30%和50%的表面肝素化复合微球具有较好的成骨诱导性,能够在一定程度上促进体外培养的BMSCs成骨分化及矿化。从而可能作为细胞载体在骨组织工程上具有潜在应用。综上所述,本工作用高压静电法制备了一系列再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球和肝素化再生纤维素/大豆分离蛋白复合微球,通过化学与物理方法对其进行了结构和理化性能表征,通过细胞活性(MTT法)和体外细胞共培养评价了其体外细胞相容性,通过红细胞孵育、溶血实验、血小板粘附实验及抗凝血实验评价了其血液相容性,并且通过与BMSCs共培养及体外诱导成骨分化实验评价了其作为细胞载体的应用潜能。为开发其在生物医学领域的应用提供了理论依据和实验数据。
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