【摘 要】
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目的:应用雨蛙肽（caerulin,CAE）及软脂酸（palmitic acid,PA）干预胰腺导管上皮细胞,模拟体内胰腺导管上皮细胞急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）和高甘油三酯血症性胰腺炎（hypertriglyceridemia pancreatitis,HTGP）环境。研究细胞凋亡、细胞质钙离子、线粒体钙离子、线粒体超微结构变化,检测线粒体单向钙离子通道复合物（mit
【基金项目】
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项目名称:高甘油三酯在高甘油三酯性胰腺炎胰管黏膜屏障损伤中对MLCK调控作用及其机制研究,项目合同编号:81560111,项目来源:国家自然科学基金,项目起止时间:2016年01月至2019年12月
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目的:应用雨蛙肽（caerulin,CAE）及软脂酸（palmitic acid,PA）干预胰腺导管上皮细胞,模拟体内胰腺导管上皮细胞急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）和高甘油三酯血症性胰腺炎（hypertriglyceridemia pancreatitis,HTGP）环境。研究细胞凋亡、细胞质钙离子、线粒体钙离子、线粒体超微结构变化,检测线粒体单向钙离子通道复合物（mitochondrial calcium uniporter complex,MCUC）相关基因及凋亡蛋白caspase-3的表达,从而探讨线粒体钙超载在CAE及PA诱导的胰腺导管上皮细胞模型中凋亡的作用机制。方法:分别用10‐7mol/L CAE、10‐7mol/L CAE加2mmol/L PA与胰腺导管上皮细胞共培养,根据干预时间点（3h、6h、12h、24h、48h）,随机分成正常对照组、CAE诱导的AP组和CAE+PA诱导的HTGP组。用倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化;用DAPI染色后,在倒置荧光显微镜下观察细胞核凋亡情况;用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。选取正常对照组和6h、12h、24h干预时间点的CAE组和CAE+PA组,利用胞质钙离子荧光染料在倒置荧光显微镜下观察细胞内钙离子水平变化,用线粒体钙离子荧光染料在多功能酶标仪下检测线粒体钙离子水平变化;用透射电子显微镜观察线粒体超微结构的变化;用实时荧光q PCR检测细胞MCU、EMRE m RNA的表达;用western blot法检测细胞MCU、EMRE、caspase-3蛋白的表达。结果:CAE、CAE+PA干预后,与正常对照组比较,胰腺导管上皮细胞形态学发生明显变化,随着干预时间的增加,细胞死亡增加。用DAPI荧光染料染色后,与正常对照组比较,CAE组和CAE+PA组细胞凋亡随着干预时间的增加而增多（P（27）0.05）,相同干预时间点,CAE+PA组细胞凋亡较CAE组明显增多（P（27）0.05）。利用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,CAE组和CAE+PA组与正常对照组比较,细胞凋亡率随干预时间的增加而明显增加,且CAE+PA组从12h时间点开始,细胞凋亡率较CAE组明显升高（P（27）0.05）。正常对照组细胞质和线粒体仅含有少量钙,CAE组和CAE+PA组与正常对照组比较,细胞质钙离子和线粒体钙离子水平随着干预时间的增加而增加（P（27）0.05）,且CAE+PA组在相同干预时间点与CAE组比较,细胞质钙超载和线粒体钙超载现象更明显（P（27）0.05）。CAE组和CAE+PA组透射电镜下线粒体形态变化明显,出现线粒体超微结构的破。CAE组和CAE+PA组MCUC相关基因MCU、EMRE m RNA和蛋白表达水平在整体上与正常对照组比较具有差异（P（27）0.05）,且CAE+PA组与CAE组比较,基因表达差异具有统计学意义（P（27）0.05）。透射电镜下观察线粒体超微结构可见经CAE、CAE+PA干预后与正常细胞比较,线粒体形态发生明显变化。同时检测caspase-3凋亡蛋白表达水平时发现,与正常对照组比较,各干预组蛋白表达均随着干预时间的增加而上调,且在6h和24h时间点,CAE+PA组与CAE组比较统计学具有差异（P（27）0.05）。结论:（1）CAE诱导模拟的体内AP环境以及CAE+PA诱导模拟的体内HTGP环境可引起胰腺导管上皮细胞凋亡增加。（2）CAE、CAE+PA可诱导细胞内Ca2+超载,通过MCUC引起线粒体Ca2+超载。（3）凋亡机制与线粒体Ca2+超载引起内源性凋亡有关。
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