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第一部分miR-9—FOXP2信号在人脑胶质母细胞瘤中表达及临床预后分析目的:检测FOXP2、miR-9在神经胶质细胞瘤组织中表达,探讨miR-9-FOXP2表达和患者临床特点、术后生存时间之间的关系。方法:选取武汉大学人民医院神经外科2015年1月至2016年12月期间共计70例胶质瘤患者病理标本,采用免疫组织化学技术及qPCR方法检测FOXP2、miR-9在胶质瘤内的表达。依据GBM中FOXP2表达水平高低排序,前20例为低表达组,后20例为高表达组,分析比较GBM与FOXP2和miR-9表达水平之间的关系。总结胶质瘤患者临床资料和随访结果,采用Kaplan—Meier方法分析FOXP2和miR-9表达水平的生存时间和预后。结果:(1)FOXP2在不同级别胶质瘤组织中均表达,高级别(WHOⅢ、Ⅳ级)胶质瘤组织中FOXP2表达阳性率大于90%。表达部位主要在细胞核,其次是细胞质。(2)FOXP2在胶质瘤不同病理类型中表达有差异,随着胶质瘤等级升高,表达升高,P<0.05。(3)FOXP2表达与胶质瘤患者性别、年龄、KPS评分及临床有无症状无明显统计学差异,P>0.05,可以使miR-9和FOXP2改变,而转染miR-9。(4)FOXP2在GBM中表达与临床预后呈负相关,高表达者生存时间短于低表达者,有统计学差异,P<0.05。(5)miR-9在胶质瘤标本中表达,表达水平高低与预后呈正相关,与FOXP2表达水平呈负相关,P<0.05。结论:(1)FOXP2蛋白在不同级别胶质瘤均有表达。(2)FOXP2蛋白表达量高低与胶质瘤病理级别和恶性程度呈正相关。(3)FOXP2蛋白水平的高低与胶质瘤预后密切有关,影响患者生活质量及预后。(4)miR-9在GBM中表达,与FOXP2表达量呈负相关。第二部分RES调控胶质瘤细胞中miR-9—FOXP2信号作用及机理目的:研究白藜芦醇对胶质母细胞瘤细胞的作用,并探索miR-9-FOXP2信号在其中的作用。方法:运用生物信息学软件Pictar、miRBase、Targetscan预测miR-9可能调控的功能靶基因,筛选miR-9调节的转录因子及蛋白。CCK8、EdU、细胞周期实验检测细胞活性和增殖,Annexin V-FITC和流式细胞术检测细胞凋亡检测白藜芦醇作用胶质瘤细胞转染miR-9 mimic和miR-9 inhibitor后转染效率,Western blot和qPCR检测U251细胞株中miR-9及FOXP2表达及作用。双荧光素酶报告鉴定miR-9直接调控靶基因FOXP2,逆转实验验证miR-9-FOXP2在白芦藜醇抑制胶质母细胞瘤中的作用。结果:(1)miRNA数据库成功筛选出FOXP2为hsa-miR-9靶基因。(2)RES抑制胶质母细胞瘤细胞U251增殖,增殖细胞数比例、细胞活性明显低于对照组,P<0.05。细胞周期阻滞于G1期,ras蛋白和cyclinD1蛋白表达降低。(3)RES促进胶质母细胞瘤细胞U251凋亡,细胞凋亡率增加,cleaved-caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,P<0.05。(4)RES调控miR-9及FOXP2蛋白表达,RES处理组FOXP2蛋白表达明显低于对照组,P<0.05,RES处理组miR-9表达高于对照组,P<0.05。(5)miR-9在胶质母细胞瘤U251细胞中调控FOXP2及下游蛋白表达,miR-9高表达后,FOXP2 表达降低,ras、cyclinD1 表达降低,cleaved-caspase3、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,P<0.05。(6)miR-9直接调控FOXP2蛋白表达,双荧光素酶报告基因表达分析,hsa-miR-9-5pmimics对FOXP2野生型和突变型载体的报告荧光有较明显的下调作用。(7)miR-9逆转实验显示RES对FOXP2的调控作用消失。(8)EGFR在胶质母细胞瘤细胞U251中的表达,RES处理组EGFR表达较对照组降低,P<0.05。结论:(1)成功筛选出FOXP2是目的miR-9的靶基因。(2)RES使胶质母细胞瘤细胞U251发生G1期阻滞,进而抑制细胞增殖。通过促进bax蛋白表达,bcl-2降低,cleaved-caspase3蛋白活性增加,促进胶质母细胞瘤细胞U251凋亡。(3)RES使胶质母细胞瘤细胞U251细胞中mir-9表达升高,FOXP2表达降低;mir9 对 FOXP2 及下游 cleaved-caspase3,bcl-2 bax,ras,cyclindl 蛋白有相同调控作用。(4)FOXP2是mir9的靶基因,RES通过调控mir-9-foxp2信号抑制胶质母细胞瘤生长。miR-9在胶质母细胞瘤细胞U251中调控FOXP2及下游蛋白表达。(5)发现了白藜芦醇新的作用靶点及FOXP2蛋白功能,促进肿瘤抑制,诱导凋亡。miR-9能够下调FOXP、EGFR基因mRNA及蛋白质的表达,hsa-miR-9-5p可能可调控带有FOXP2基因该段3’UTR的基因的表达。第三部分RES体内调节miR-9-FOXP2信号抑制胶质瘤生长目的:观察白藜芦醇作用裸鼠中肿瘤生长影响和作用,分析裸鼠组织中FOXP2蛋白表达,探讨miR-9-FOXP2信号在白藜芦醇体内抗肿瘤的作用。方法:BALB/C裸鼠皮下移植U251胶质瘤细胞建立裸鼠模型,白藜芦醇50mmol/L每隔三天灌胃,动态记录肿瘤体积和重量变化,观察移植鼠的肿瘤生长情况。裸鼠皮下荷瘤标本固定,石蜡包埋,HE染色,qPCR和Western blot法检测miR-9和FOXP2蛋白表达表达水平变化,肿瘤组织病理学改变。结果:(1)成功建立瘤鼠皮下裸鼠成瘤生长情况,5天后肿瘤体积约6mm3,成瘤率100%。(2)白藜芦醇对裸鼠种植瘤生长抑制作用,RES组肿瘤生长速度及体积较DMSO组减慢,第21天及第24天移植瘤体积大小相比两组差异有统计学意义,第21 天 P=0.0231,第 24 天 P=0.009,。(3)RES抑制胶质瘤生长,RES组裸鼠出现明显皮肤破溃及肿瘤出血坏死明显少于DMSO组。(4)FOXP2在RES和DMSO裸鼠组中的表达,RES作用裸鼠后,WB检测FOXP2蛋白,两组间FOXP2相对表达量有差异,有统计学意义,P<0.001。(5)裸鼠肿瘤组织中miR-9与FOXP2相关性分析显示两者呈负相关,RES组mir-9表达量高于对照组,差异具有统计学意义,P=0.0038,P<0.01。结论(1)一定剂量的白藜芦醇能在裸鼠体内发挥抗瘤作用,白藜芦醇抑制肿瘤生长。(2)白藜芦醇能在裸鼠体内发挥抗瘤作用,随用药时间延长出现抗瘤效应。(3)白藜芦醇能降低胶质瘤细胞内FOXP2表达。(4)白藜芦醇通过miR-9—FOXP2信号发挥抗瘤作用。