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从古至今,植物源性食用油一直是人类得以健康生活的保证。近年来,许多农业公司利用包括转基因技术在内的现代生物技术开发新的植物品系。由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的主要热点,已有30多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标签。目前,许多未经标签和认证的转基因生物及其深加工产品可能已经进入中国市场,这就迫切地需要合适的检测手段以确定这些食品中是否含有转基因成分。
以油脂为材料提取 DNA 进行分子生物学研究的关键是能否提取到高质量的油脂DNA。自DNA分析技术兴起后,国内外在这方面做出了巨大的成就,发展了多种转基因食品DNA检测方法。但仍存在以下问题:①各种提取方法通用性不好。在许多实验中存在扩增成功率在物种和食品种类之间的差异。虽然专用DNA提取试剂盒有较好的通用性,但昂贵的价格限制了该试剂盒的广泛应用,因此构建一套效果好、通用性好、性价比高的油脂DNA提取方法,可以大大推进油脂DNA技术的推广。②对外源基因最佳PCR检测方法的摸索,检验灵敏度和效率都不高。
本文以4种植物油为材料,分别构建了2种新的DNA提取方法解决现存的问题;分别用普通PCR和降落PCR检测转基因成分,并对其反应体系和条件进行优化,主要结果如下:
1、本论文中构建的改进型CTAB提取方法广泛适用于各种植物油DNA提取,仅一次提取即得到高质量的模板DNA,成功率高,一般不需重复提取,对PCR产物的扩增结果也证实了方法的可靠性和通用性。虽然有些公司的油脂DNA提取专用试剂盒也有着较好的通用性,但其昂贵的价格(25元/次)使其在大量分析样品时受到很大的限制。与之相比,本方法成本低廉,每提取一个样品的成本低于 3 元,用实验室常用试剂即可完成油脂DNA提取,同时产物纯度高于专用试剂盒。即拥有超过专业试剂盒的提取效果,又尽可能的降低了实验成本,真正实现了实验室通用性,有利于油脂DNA技术的迅速推广。
2、本研究中还利用快速蛋白液相色谱法(Fast protein liquid chromatographyFPLC),通过阴离子交换柱分离纯化DNA,提高了产物的纯度,关键是可以把完整基因组DNA与DNA片断分开,同时节省了提取时间,回收率高,适宜少量样品的快速DNA提取。
3、通过优化实验对普通PCR法检测外源基因进行分析,得出以下最佳反应条件:①Mg<,2+> 浓度为 2.5mmol/L、引物浓度为 0.1μmol/L.至0.4μmol/L、dNTPs 浓度200μmol/L,Taq酶添加量为5U。最佳退火温度为54.8℃(CaMV35S)和53.2℃(NOS)。
4、通过优化实验对降落PCR法检测外源基因进行分析,并与普通PCR法作比较,证明了TD-PCR明显提高了普通PCR检测特异性和效率,更大程度上避免了假阳性产物的存在,可提供一种比普通PCR更可靠灵敏的转基因成分定性检测方法。