鼠源CD40L的原核表达及其对两种毒素半抗原免疫增强效果分析

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通过构建大肠杆菌表达系统表达鼠源重组CD40L蛋白,探讨其对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)、微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MC-LR)在免疫BALB/c小鼠的过程中的免疫增强作用,为进一步开发适于小分子半抗原单克隆抗体高效制备的免疫增强佐剂提供新的思路和实验基础。用Trizol试剂提取BALB/c小鼠脾脏总RNA并反转录成cDNA,根据CD40L CDs区以及可溶性CD40L(sCD40L)区设计引物,PCR扩增目的基因,构建pGEX4T-1-CD40L和pET-28a-sCD40L重组载体,进行原核表达,并纯化重组CD40L以及sCD40L蛋白。根据曼尼希反应原理,用甲醛法制备TTX免疫原TTX-BSA和检测原TTX-OVA;以人工重组蛋白CD40L佐剂组为试验组,弗氏佐剂组作为对照组,免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法结合SPSS软件分析各组血清抗体水平,探讨重组CD40L蛋白在TTX-BSA免疫过程中对免疫效果的影响。用碳二亚胺法将MC-LR与BSA和OVA偶联,制备免疫原MC-LR-BSA和检测原MC-LR-OVA;以人工重组蛋白sCD40L佐剂组为试验组,弗氏佐剂组作为对照组,免疫BALB/c小鼠,用ELISA方法结合SPSS软件分析各组血清抗体水平,探讨重组sCD40L蛋白在MC-LR以及MC-LR-BSA免疫过程中对免疫效果的影响。参照GenBank中鼠β-actin、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5以及CD19、CD21、CD80、CD86、CD138 mRNA的保守序列经查询基因库和使用Primer Premier 5.0软件分别设计上下游引物,以小鼠脾脏RNA的反转录产物cDNA为模板,用SYBR Green I实时荧光定量PCR法检测细胞因子以及CD分子的转录水平。用小鼠白细胞介素ELISA检测试剂盒,采用双抗体一步夹心酶联免疫吸附法检测小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5的表达水平。结果显示,本实验成功扩增了783 bp的CD40L和包含sCD40L区的505 bp的目的基因,分别原核表达并纯化了融合GST标签的55 kDa鼠源CD40L重组蛋白和融合了His标签的18 kDa的鼠源sCD40L重组蛋白。重组CD40L蛋白在与人工制备的TTX-BSA协同免疫小鼠试验结果显示,在免疫初期与普通弗氏佐剂相比,CD40L具有更好的增强免疫的效果(P<0.01)。sCD40L重组蛋白在与MC-LR半抗原和MC-LR-BSA人工完全抗原协同免疫小鼠实验结果显示,sCD40L不仅能使机体对MC-LR半抗原产生免疫应答反应,而且能达到与弗氏佐剂相当的免疫增强效果,起效比弗氏佐剂快。进一步的研究证实,sCD40L能与CD40受体结合,促进DC细胞成熟,刺激CD80和CD86的转录表达、促进B细胞增值和转化成浆细胞、刺激Th1和Th2类细胞因子的转录和表达,且对Th2型免疫反应的增强效果更强。综上所述,不论是CD40L还是sCD40L均能增强机体对小分子抗原的免疫应答反应,比起需要将小分子与蛋白偶联再与佐剂乳化才能使用的弗氏佐剂,CD40L/sCD40L佐剂使用简单、起效快,为进一步开发适于小分子半抗原抗体高效制备的免疫增强佐剂奠定试验基础。
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